انعكاس التداخل المتزامن والمجهر الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بها
Summary
نقدم بروتوكولا لتنفيذ الفحص المجهري لانعكاس التداخل والمجهر الفلوري الداخلي الكلي للتصوير المتزامن للأنابيب الدقيقة الديناميكية والبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة ذات العلامات الفلورية.
Abstract
تم استخدام العديد من التقنيات للتصور المباشر للخيوط الهيكلية الخلوية والبروتينات المرتبطة بها. يحتوي الفحص المجهري الكلي الداخلي للانعكاس والتألق (TIRF) على نسبة إشارة إلى خلفية عالية ، لكنه يعاني من التبييض الضوئي والتلف الضوئي للبروتينات الفلورية. التقنيات الخالية من الملصقات مثل الفحص المجهري لانعكاس التداخل (IRM) والفحص المجهري للتشتت التداخل (iSCAT) تتحايل على مشكلة التبييض الضوئي ولكنها لا تستطيع تصور جزيئات مفردة بسهولة. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للجمع بين IRM ومجهر TIRF التجاري للتصوير المتزامن للبروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) والأنابيب الدقيقة الديناميكية في المختبر. يسمح هذا البروتوكول بمراقبة عالية السرعة ل MAPs التي تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة الديناميكية. يعمل هذا على تحسين إعدادات TIRF الحالية ذات اللونين من خلال القضاء على كل من الحاجة إلى وضع العلامات على الأنابيب الدقيقة والحاجة إلى العديد من المكونات البصرية الإضافية ، مثل ليزر الإثارة الثاني. يتم تصوير كلتا القناتين على نفس شريحة الكاميرا لتجنب مشاكل تسجيل الصور ومزامنة الإطارات. يتم توضيح هذا الإعداد من خلال تصور جزيئات كينيسين واحدة تمشي على الأنابيب الدقيقة الديناميكية.
Introduction
يستخدم المجهر الكلي الداخلي الانعكاسي الفلوري (TIRF) بشكل شائع لتصور جزيئات الفلورسنت المفردة. بالمقارنة مع التصوير اللافلوري ، يحقق TIRF قمعا فائقا للخلفية ، مما يسمح بتوطين عالي الدقة وتتبع الفلوروفورات المفردة. لهذا السبب ، فإن TIRF هي الطريقة المفضلة لتصور البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة المصنفة بالفلورسنت وكثيرا ما تستخدم لتصوير الأنابيب الدقيقة 1,2.
للتحقيق في تنظيم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بواسطة MAPs ، غالبا ما يكون من الضروري تصوير كل من الأنابيب الدقيقة و MAPs في وقت واحد. معظم الطرق الحالية لهذا الغرض باهظة الثمن أو تعاني من عيوب فنية. على سبيل المثال ، يتطلب TIRF ثنائي اللون في وقت واحد اثنين من ليزر الإثارة وكاميرتين. بالإضافة إلى التكلفة العالية ، فإن الحاجة إلى كاميرات منفصلة تطرح مشاكل في مزامنة الإطار وتسجيل الصور. يمكن التحايل على هذه الحاجة إذا تم استخدام مكعب مرشح دوار للتبديل فعليا بين ليزر الإثارة في إطارات متتالية3. في مثل هذا الإعداد ، يمكن استخدام شريحة كاميرا واحدة ، وتتناوب الإطارات بين صور الأنابيب الدقيقة و MAPs. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية محدودة بسرعة تغيير المرشح ، والتي عادة ما تقيد معدل الإطارات إلى أقل من 0.5 إطار في الثانية3 (fps). معدل الإطار هذا غير كاف لحل العمليات الديناميكية السريعة ، مثل انكماش النبيب الدقيق الذي يحدث بسرعة تصل إلى 500 نانومتر / ثانية ، أو سير كينيسين بسرعة 800 نانومتر / ثانية ، أو انتشار MAP يحدث مع معاملات انتشار تتجاوز 0.3 ميكرومتر2 / ث4. ويمثل ذلك إشكالية خاصة عند تتبع المواقع النسبية لهدفين متحركين في كل قناة، مثل موضع MAP بالنسبة لموضع طرف الأنابيب الدقيقة المتحركة5.
بالإضافة إلى هذه القيود البصرية ، يتطلب الفحص المجهري TIRF ثنائي اللون وضع علامة على MAPs و microtubules مع الفلوروفورات المختلفة التي يتم فصل أطياف انبعاثاتها بشكل كاف. يمكن أن يغير وضع العلامات الفلورية للتوبولين ديناميكيات الأنابيب الدقيقة6 ، ويحد التبييض الضوئي للفلوروفورات من سرعة التصوير7. بسبب هذه المشكلات ، تم تطوير تقنيات تصوير خالية من الملصقات لتصور الأنابيب الدقيقة. وتشمل هذه المجهر التداخل التداخل (iSCAT)8,9 ، والمجهر الدوار المتماسك المبعثر (ROCS)10 ، ومجهر تداخل الضوء المكاني (SLIM)11 ، ومجهر انعكاس التداخل (IRM) 12,13. تسمح هذه التقنيات بالتصوير السريع الخالي من الملصقات للأنابيب الدقيقة دون عيوب التصوير الفلوري ، ولكن لا يمكن استخدامها لتصور MAPs الفردية.
من بين هذه التقنيات الخالية من الملصقات ، تبرز IRM لتكلفتها المنخفضة ومطالبها المتواضعة على الأجهزة. لقد قدمنا مؤخرا بروتوكولا للجمع بين IRM ومجهر TIRF التجاري ، مما يسمح بتصوير الأنابيب الدقيقة و MAPs الفلورية في إطارات متناوبة 3,13. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتعديل هذا الإعداد لالتقاط صور TIRF و IRM في وقت واحد على شريحة كاميرا واحدة. يتضمن ذلك إضافة مقسم شعاع غير مكلف في مسار الإثارة لإلقاء الضوء على العينة في وقت واحد باستخدام ليزر TIRF ومصدر ضوء IRM LED. يتم استخدام مقسم صور تجاري معدل لفصل إشارات TIRF و IRM بشكل مرئي وعرضها على نصفين منفصلين من نفس شريحة الكاميرا. كما أننا نستخدم نظام الموائع الدقيقة الذي يسمح بالتبادل السريع للكواشف أثناء التصوير. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام هذا الإعداد لتصوير الأنابيب الدقيقة الديناميكية و MAPs. يتم إثبات قدرة الجهاز من خلال تقديم أول تصور لبروتينات كينيسين -1 التي تمشي على الأنابيب الدقيقة المتقلصة ، والتي يتم التقاطها بمعدل إطار 10 s-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
غالبا ما تتطلب دراسة تنظيم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بواسطة البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) تصويرا متزامنا للأنابيب الدقيقة و MAPs. عادة ما يتم استخدام تقنيات الفحص المجهري الفلوري مثل TIRF لهذا الغرض. ومع ذلك ، فهي محدودة بعيوب التصوير الفلوري ، والتي تشمل التبييض الضوئي ، والضرر الضوئي ، والحاجة إلى وضع العلامات الفلورية. الطرق الخالية من الملصقات ، مثل IRM ، مناسبة لتصور الأنابيب الدقيقة ولكنها غير قادرة على تصوير الفلوروفورات المفردة. يجمع هذا البروتوكول بين تصوير IRM الخالي من الملصقات والفحص المجهري TIRF للتصوير المتزامن للأنابيب الدقيقة الديناميكية و MAPs.
يستخدم إعداد IRM مصدر إضاءة LED تمت تصفيته إلى >600 نانومتر ، بينما يستخدم إعداد TIRF ليزر 488 نانومتر. استخدمنا مقسم شعاع لوحة غير مكلف لعكس ضوء الإضاءة على العينة ونقل الإشارة المجمعة إلى الكاشف (الشكل 1). تم اختيار مقسم شعاع مع انعكاس 10٪ وانتقال 90٪ لتقليل فقدان إشارة الجزيء الواحد. يتم تعويض الخسارة بنسبة 90٪ في شدة ضوء الإضاءة عن طريق زيادة قوة ليزر الإضاءة و LED.
وتحقق الفصل الطيفي للإشارات باستخدام مقسم شعاع 90/10 (R/T) ومرشحين طيفيين (600 نانومتر للتمرير الطويل ل IRM وتمرير النطاق 535/50 نانومتر ل TIRF). يتم عرض إشارات IRM و TIRF المنفصلة طيفيا على نصفين من شريحة كاميرا واحدة باستخدام مجموعة مقسم الصور. يضحي استخدام مقسم شعاع 90/10 بنسبة 90٪ من إشارة IRM ، ولكن يتم تعويض ذلك عن طريق زيادة شدة مصدر إضاءة LED. يمكن أيضا استخدام مرآة ثنائية اللون هنا لفصل إشارات IRM و TIRF بشكل أكثر كفاءة. تتيح الميكروبيدات الفلورية المضمنة في الفحوصات محاذاة دقيقة لصور TIRF و IRM وتعمل كمرجع لتركيز الهدف.
العنصر البصري الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو هدف الفتحة العددية العالية (NA). هذا أمر ضروري ليس فقط لتحقيق الانعكاس الداخلي الكلي ولكن أيضا لتحقيق أقصى قدر من كفاءة المجموعة وتباين الصورة. تعتمد جودة الصور التي تم الحصول عليها أيضا على نظافة السطح الزجاجي والحصول على صورة خلفية واضحة لتصحيح الإضاءة غير الموحدة وإزالة الميزات الثابتة. بالنسبة لتصوير IRM ، نوصي باستخدام إضاءة الطول الموجي الطويل (>600 نانومتر) لتقليل الضرر الضوئي للأنابيب الدقيقة والبروتينات. هذا مهم بشكل خاص إذا تم استخدام مصدر ضوء LED أبيض ، وفي هذه الحالة يجب تضمين مرشح طويل المرور لإزالة أي ضوء للأشعة فوق البنفسجية.
يسمح هذا البروتوكول بالتصوير عالي السرعة بدون ملصقات للأنابيب الدقيقة الديناميكية والتصور المتزامن عالي الدقة ل MAPs17 الفلورية. بالمقارنة مع تقنية تبديل مكعب المرشح ، والتي تتناوب بين التقاط صور للأنابيب الدقيقة و MAPs ، فإن هذا الإعداد قادر على معدلات إطارات أعلى بكثير لأنه لا يعتمد على الدوران المادي لمكعب المرشح. بالمقارنة مع تقنيات التصوير TIRF بلونين ، تستخدم هذه التقنية إعدادا بصريا أقل تطلبا وتتحايل على الحاجة إلى وضع العلامات الفلورية على الأنابيب الدقيقة. ترجع القيود الأساسية لهذا الإعداد إلى تصوير TIRF ل MAPs. معدل الإطار محدود بوقت التعرض للفلوروفور ، ولا يزال التبييض الضوئي للفلوروفورات احتمالا. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول يحسن التقنيات الحالية لأنه يستخدم TIRF فقط عند الضرورة (أي لتصور MAPs ولكن ليس microtubules) ويحقق أعلى سرعة ممكنة في حدود TIRF. لا يمكن إجراء المزيد من التحسينات إلا إذا تم تصور كل من الأنابيب الدقيقة و MAPs عبر تقنية قياس التداخل ، ولكن هذا يتطلب وضع علامات على MAPs بجسيمات نانوية معدنية ، والتي لها حدودها وتحدياتها التجريبية.
لإثبات قدرات هذه التقنية ، قمنا في وقت واحد بتصور عمليتين ديناميكيتين سريعتين عبر IRM و TIRF: انكماش الأنابيب الدقيقة والمشي في جزيء كينيسين الفلورسنت. تم استخدام هذه التقنية سابقا لتصور الانتشار السريع للسباستين على الأنابيب الدقيقة المتقلصة5. بالإضافة إلى هذا التطبيق على MAPs و microtubules ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور جزيئات الفلورسنت المفردة في وقت واحد مع أي بنية جزيئية كبيرة ضخمة بما يكفي لتصورها عبر IRM ، مثل غشاء الخلية أو خيوط الأكتين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مختبر تييري إيمونيه على مشاركة معدات غرف الأبحاث. نشكر Yin-Wei Kuo على إعداد eGFP-kinesin المنقى المستخدم في هذه الدراسة. تعترف Y.T. بدعم مؤسسة ألكسندر فون هومبولت من خلال زمالة فيودور لينين للأبحاث. تم دعم هذا العمل من قبل NIH Grant R01 GM139337 (إلى J.H.).
Materials
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -. W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -. W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V., Astratov, V. . Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. , 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy). Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. Microfabrication in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
