Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine
Summary
Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.
Abstract
Für die direkte Visualisierung von zytoskelettalen Filamenten und ihren assoziierten Proteinen wurden mehrere Techniken eingesetzt. Die TIRF-Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie hat ein hohes Signal-Hintergrund-Verhältnis, leidet jedoch unter Photobleichen und Photoschäden der fluoreszierenden Proteine. Markierungsfreie Techniken wie die Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) und die interferometrische Streumikroskopie (iSCAT) umgehen das Problem der Photobleiche, können aber einzelne Moleküle nicht ohne weiteres visualisieren. Dieses Papier stellt ein Protokoll zur Kombination von IRM mit einem kommerziellen TIRF-Mikroskop für die gleichzeitige Bildgebung von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) und dynamischen Mikrotubuli in vitro vor. Dieses Protokoll ermöglicht die Hochgeschwindigkeitsbeobachtung von MAPs, die mit dynamischen Mikrotubuli interagieren. Dies verbessert bestehende zweifarbige TIRF-Setups, da sowohl die Mikrotubuli-Markierung als auch die Notwendigkeit mehrerer zusätzlicher optischer Komponenten, wie z. B. eines zweiten Anregungslasers, entfallen. Beide Kanäle werden auf demselben Kamerachip abgebildet, um Bildregistrierungs- und Bildsynchronisationsprobleme zu vermeiden. Dieser Aufbau wird durch die Visualisierung einzelner Kinesinmoleküle demonstriert, die auf dynamischen Mikrotubuli laufen.
Introduction
Die TIRF-Mikroskopie (Total-Internal-Reflection-Fluorescence) wird häufig zur Visualisierung einzelner fluoreszierender Moleküle eingesetzt. Im Vergleich zur Epifluoreszenzbildgebung erreicht TIRF eine überlegene Hintergrundausblendung, die eine hochauflösende Lokalisierung und Verfolgung einzelner Fluorophore ermöglicht. Aus diesem Grund ist TIRF die bevorzugte Methode zur Visualisierung fluoreszenzmarkierter Mikrotubuli-assoziierter Proteine und wird häufig zur Abbildung von Mikrotubuli 1,2 verwendet.
Um die Regulation der Mikrotubulidynamik durch MAPs zu untersuchen, ist es oft notwendig, sowohl Mikrotubuli als auch MAPs gleichzeitig abzubilden. Die meisten bestehenden Methoden für diesen Zweck sind teuer oder leiden unter technischen Nachteilen. Simultane Zweifarben-TIRF benötigt beispielsweise zwei Anregungslaser und zwei Kameras. Zusätzlich zu den hohen Kosten wirft die Notwendigkeit separater Kameras Probleme bei der Bildsynchronisation und Bildregistrierung auf. Diese Notwendigkeit kann umgangen werden, wenn ein rotierender Filterwürfel verwendet wird, um physisch zwischen Anregungslasern in aufeinanderfolgenden Bildern zu wechseln3. In einem solchen Setup kann ein einzelner Kamerachip verwendet werden, und die Rahmen wechseln zwischen Bildern von Mikrotubuli und MAPs. Diese Technik ist jedoch durch die Geschwindigkeit des Filterwechsels begrenzt, die die Bildrate typischerweise auf weniger als 0,5 Bilder pro Sekunde3 (fps) beschränkt. Eine solche Bildrate reicht nicht aus, um schnelle dynamische Prozesse aufzulösen, wie z.B. die Schrumpfung eines Mikrotubuli mit einer Geschwindigkeit von bis zu 500 nm/s, das Gehen eines Kinesins mit einer Geschwindigkeit in der Größenordnung von 800 nm/s oder die Diffusion eines MAP mit Diffusionskoeffizienten von mehr als 0,3 μm2/s4. Dies ist besonders problematisch, wenn die relativen Positionen von zwei sich bewegenden Zielen in jedem Kanal verfolgt werden, z. B. die Position eines MAP relativ zur Position einer sich bewegenden Mikrotubulispitze5.
Zusätzlich zu diesen optischen Einschränkungen erfordert die Zwei-Farben-TIRF-Mikroskopie, dass MAPs und Mikrotubuli mit verschiedenen Fluorophoren markiert werden, deren Emissionsspektren ausreichend getrennt sind. Die fluoreszierende Markierung von Tubulin kann die Mikrotubulidynamikverändern 6, und das Photobleichen von Fluorophoren begrenzt die Bildgebungsgeschwindigkeit7. Aufgrund dieser Probleme wurden markierungsfreie Bildgebungstechniken entwickelt, um Mikrotubuli sichtbar zu machen. Dazu gehören die interferometrische Streumikroskopie (iSCAT) 8,9, die rotierend-kohärente Streumikroskopie (ROCS)10, die räumliche Lichtinterferenzmikroskopie (SLIM)11 und die Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) 12,13. Diese Techniken ermöglichen eine schnelle markierungsfreie Bildgebung von Mikrotubuli ohne die Nachteile der Fluoreszenzbildgebung, aber sie können nicht zur Visualisierung einzelner MAPs verwendet werden.
Von diesen labelfreien Techniken zeichnet sich IRM durch seine niedrigen Kosten und seine bescheidenen Anforderungen an die Instrumentierung aus. Wir haben kürzlich ein Protokoll zur Kombination von IRM mit einem kommerziellen TIRF-Mikroskop vorgestellt, mit dem Mikroskope und fluoreszierende MAPs in abwechselnden Frames 3,13 abgebildet werdenkönnen. In diesem Dokument wird ein Protokoll zum Ändern dieses Setups vorgestellt, um gleichzeitig TIRF- und IRM-Bilder auf einem einzigen Kamerachip zu erfassen. Dabei wird ein kostengünstiger Strahlteiler in den Anregungspfad aufgenommen, um die Probe gleichzeitig mit einem TIRF-Laser und einer IRM-LED-Lichtquelle zu beleuchten. Ein modifizierter kommerzieller Bildsplitter wird verwendet, um die TIRF- und IRM-Signale spektral zu trennen und auf separate Hälften desselben Kamerachips zu projizieren. Wir verwenden auch ein mikrofluidisches System, das den schnellen Austausch von Reagenzien während der Bildgebung ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt, wie dieses Setup verwendet werden kann, um dynamische Mikrotubuli und MAPs abzubilden. Die Leistungsfähigkeit der Apparatur wird durch die Präsentation der ersten Visualisierung von Kinesin-1-Proteinen demonstriert, die auf schrumpfenden Mikrotubuli laufen, die mit einer Bildrate von 10 s-1 erfasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Untersuchung der Regulation der Mikrotubulidynamik durch Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) erfordert häufig die gleichzeitige Abbildung von Mikrotubuli und MAPs. Fluoreszenzmikroskopie-Techniken wie TIRF werden typischerweise für diesen Zweck eingesetzt. Sie sind jedoch durch die Nachteile der Fluoreszenzbildgebung begrenzt, zu denen Photobleichen, Lichtschäden und die Notwendigkeit einer Fluorophormarkierung gehören. Markierungsfreie Methoden wie IRM eignen sich für die Visualisierung von Mikrotubuli, sind jedoch nicht in der Lage, einzelne Fluorophore abzubilden. Dieses Protokoll kombiniert markierungsfreie IRM-Bildgebung und TIRF-Mikroskopie für die gleichzeitige Bildgebung von dynamischen Mikrotubuli und MAPs.
Das IRM-Setup verwendet eine LED-Beleuchtungsquelle, die auf >600 nm gefiltert ist, während das TIRF-Setup einen 488-nm-Laser verwendet. Wir verwendeten einen kostengünstigen Plattenstrahlteiler, um das Beleuchtungslicht auf die Probe zu reflektieren und das gesammelte Signal an den Detektor zu übertragen (Abbildung 1). Ein Strahlteiler mit 10% Reflexion und 90% Transmission wurde gewählt, um den Verlust des Einzelmolekülsignals zu minimieren. Der 90%ige Verlust der Beleuchtungslichtintensität wird durch eine Erhöhung der Leistung von Beleuchtungslaser und LED kompensiert.
Die spektrale Trennung der Signale wurde mit einem 90/10 (R/T) Strahlteiler und zwei Spektralfiltern (Long-Pass 600 nm für IRM und Bandpass 535/50 nm für TIRF) erreicht. Die spektral getrennten IRM- und TIRF-Signale werden mithilfe einer Bildteilerbaugruppe auf zwei Hälften eines einzelnen Kamerachips projiziert. Die Verwendung eines 90/10-Strahlteilers opfert 90% des IRM-Signals, was jedoch durch die Erhöhung der Intensität der LED-Beleuchtungsquelle ausgeglichen wird. Auch hier könnte ein dichroitischer Spiegel eingesetzt werden, um die IRM- und TIRF-Signale effizienter zu trennen. Fluoreszierende Mikrokügelchen, die in den Assays enthalten sind, ermöglichen eine genaue Ausrichtung der TIRF- und IRM-Bilder und dienen als Referenz für die Fokussierung des Objektivs.
Das kritischste optische Element in diesem Protokoll ist das Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA). Dies ist nicht nur wichtig, um eine totale interne Reflexion zu erreichen, sondern auch, um die Sammlungseffizienz und den Bildkontrast zu maximieren. Die Qualität der erhaltenen Bilder hängt auch von der Sauberkeit der Glasoberfläche und der Aufnahme eines klaren Hintergrundbildes ab, um eine ungleichmäßige Ausleuchtung zu korrigieren und statische Merkmale zu entfernen. Für die IRM-Bildgebung empfehlen wir die Verwendung einer langwelligen Beleuchtung (>600 nm), um die Lichtschäden von Mikrotubuli und Proteinen zu minimieren. Dies ist besonders wichtig, wenn eine weiße LED-Lichtquelle verwendet wird, in diesem Fall sollte ein Langpassfilter enthalten sein, um UV-Licht zu entfernen.
Dieses Protokoll ermöglicht eine markierungsfreie Hochgeschwindigkeitsbildgebung dynamischer Mikrotubuli und die gleichzeitige hochauflösende Visualisierung fluoreszierender MAPs17. Im Vergleich zur Filterwürfel-Schalttechnik, die zwischen der Aufnahme von Bildern von Mikrotubuli und MAPs wechselt, ist dieser Aufbau in der Lage, viel höhere Bildraten zu erzielen, da er nicht von der physischen Rotation eines Filterwürfels abhängt. Im Vergleich zu zweifarbigen TIRF-Bildgebungsverfahren verwendet diese Technik einen weniger anspruchsvollen optischen Aufbau und umgeht die Notwendigkeit einer Fluorophormarkierung von Mikrotubuli. Die Haupteinschränkungen dieses Aufbaus sind auf die TIRF-Bildgebung der MAPs zurückzuführen. Die Bildrate ist durch die Belichtungszeit eines Fluorophors begrenzt, und das Photobleichen von Fluorophoren bleibt eine Möglichkeit. Nichtsdestotrotz verbessert dieses Protokoll bestehende Techniken, da es TIRF nur bei Bedarf verwendet (dh zur Visualisierung von MAPs, aber nicht von Mikrotubuli) und die höchstmögliche Geschwindigkeit innerhalb der Grenzen von TIRF erreicht. Weitere Verbesserungen sind nur möglich, wenn sowohl die Mikrotubuli als auch die MAPs über eine interferometrische Technik visualisiert werden, aber dies erfordert die Markierung von MAPs mit Metallnanopartikeln, was ihre Grenzen und experimentellen Herausforderungen hat.
Um die Fähigkeiten dieser Technik zu demonstrieren, visualisierten wir gleichzeitig zwei schnelle dynamische Prozesse über IRM und TIRF: die Schrumpfung eines Mikrotubuli und das Gehen eines fluoreszierenden Kinesinmoleküls. Diese Technik wurde zuvor eingesetzt, um die schnelle Diffusion von Spastin auf schrumpfenden Mikrotubuli zu visualisieren5. Über diese Anwendung auf MAPs und Mikrotubuli hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um einzelne fluoreszierende Moleküle gleichzeitig mit jeder makromolekularen Struktur zu visualisieren, die groß genug ist, um über IRM sichtbar gemacht zu werden, wie z. B. eine Zellmembran oder ein Aktinfilament.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Labor von Thierry Emonet für die gemeinsame Nutzung von Reinraumgeräten. Wir danken Yin-Wei Kuo für die Vorbereitung des in dieser Studie verwendeten gereinigten eGFP-Kinesins. Y.T. würdigt die Unterstützung der Alexander von Humboldt-Stiftung durch das Feodor-Lynen-Forschungsstipendium. Diese Arbeit wurde durch NIH Grant R01 GM139337 (an J.H.) unterstützt.
Materials
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -. W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -. W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V., Astratov, V. . Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. , 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy). Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. Microfabrication in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
