Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate
Summary
Presentiamo un protocollo per l’implementazione della microscopia a riflessione di interferenza e della microscopia a riflessione totale interna-fluorescenza per l’imaging simultaneo di microtubuli dinamici e proteine associate a microtubuli marcati fluorescenti.
Abstract
Diverse tecniche sono state impiegate per la visualizzazione diretta dei filamenti citoscheletrici e delle proteine associate. La microscopia a riflessione totale interna (TIRF) ha un elevato rapporto segnale-sfondo, ma soffre di fotosbiancamento e fotodanneggiamento delle proteine fluorescenti. Tecniche prive di etichette come la microscopia a riflessione di interferenza (IRM) e la microscopia a dispersione interferometrica (iSCAT) aggirano il problema del fotosbiancamento ma non possono visualizzare facilmente le singole molecole. Questo documento presenta un protocollo per combinare IRM con un microscopio TIRF commerciale per l’imaging simultaneo di proteine associate a microtubuli (MAP) e microtubuli dinamici in vitro. Questo protocollo consente l’osservazione ad alta velocità delle MAP che interagiscono con microtubuli dinamici. Ciò migliora le configurazioni TIRF a due colori esistenti eliminando sia la necessità di etichettatura dei microtubuli che la necessità di diversi componenti ottici aggiuntivi, come un secondo laser di eccitazione. Entrambi i canali vengono ripresi sullo stesso chip della fotocamera per evitare problemi di registrazione delle immagini e di sincronizzazione dei fotogrammi. Questa configurazione è dimostrata visualizzando singole molecole di chinesina che camminano su microtubuli dinamici.
Introduction
La microscopia a riflessione totale interna (TIRF) è comunemente impiegata per la visualizzazione di singole molecole fluorescenti. Rispetto all’imaging in epifluorescenza, TIRF raggiunge una soppressione dello sfondo superiore, consentendo la localizzazione ad alta risoluzione e il tracciamento di singoli fluorofori. Per questo motivo, TIRF è il metodo preferito per visualizzare proteine associate a microtubuli marcate fluorescenti ed è spesso utilizzato per visualizzare i microtubuli 1,2.
Per studiare la regolazione della dinamica dei microtubuli da parte delle MAP, è spesso necessario visualizzare contemporaneamente sia i microtubuli che i MAP. La maggior parte dei metodi esistenti per questo scopo sono costosi o soffrono di inconvenienti tecnici. Il TIRF simultaneo a due colori, ad esempio, richiede due laser di eccitazione e due telecamere. Oltre al costo elevato, la necessità di telecamere separate pone problemi di sincronizzazione dei fotogrammi e di registrazione delle immagini. Questa necessità può essere aggirata se si utilizza un cubo filtrante rotante per passare fisicamente da un laser di eccitazione all’altro in fotogrammi consecutivi3. In tale configurazione, è possibile utilizzare un singolo chip della fotocamera e i fotogrammi si alternano tra immagini di microtubuli e MAP. Questa tecnica, tuttavia, è limitata dalla velocità del cambio di filtro, che in genere limita la frequenza dei fotogrammi a meno di 0,5 fotogrammi al secondo3 (fps). Tale frame rate è insufficiente per risolvere processi dinamici veloci, come il restringimento di un microtubulo che si verifica ad una velocità fino a 500 nm/s, la camminata di una chinesina ad una velocità dell’ordine di 800 nm/s, o la diffusione di un MAP che si verifica con coefficienti di diffusione superiori a 0,3 μm2/s4. Ciò è particolarmente problematico quando si tracciano le posizioni relative di due bersagli in movimento in ciascun canale, come la posizione di un MAP rispetto alla posizione di una punta di microtubuli in movimento5.
Oltre a questi vincoli ottici, la microscopia TIRF a due colori richiede che i MAP e i microtubuli siano etichettati con diversi fluorofori i cui spettri di emissione sono sufficientemente separati. L’etichettatura fluorescente della tubulina può alterare la dinamica dei microtubuli6 e la fotosbiancamento dei fluorofori limita la velocità di imaging7. A causa di questi problemi, sono state sviluppate tecniche di imaging senza etichetta per visualizzare i microtubuli. Questi includono la microscopia a dispersione interferometrica (iSCAT)8,9, la microscopia a dispersione coerente rotante (ROCS)10, la microscopia a interferenza della luce spaziale (SLIM)11 e la microscopia a riflessione di interferenza (IRM)12,13. Queste tecniche consentono un’imaging veloce senza etichette di microtubuli senza gli inconvenienti dell’imaging a fluorescenza, ma non possono essere utilizzate per visualizzare singole MAP.
Di queste tecniche senza etichette, IRM si distingue per il suo basso costo e le sue modeste esigenze di strumentazione. Abbiamo recentemente presentato un protocollo per combinare IRM con un microscopio TIRF commerciale, consentendo di visualizzare microtubuli e MAP fluorescenti in fotogrammi alternati 3,13. Questo documento presenta un protocollo per modificare questa configurazione per acquisire contemporaneamente immagini TIRF e IRM su un singolo chip della fotocamera. Ciò comporta l’aggiunta di uno splitter a fascio economico nel percorso di eccitazione per illuminare contemporaneamente il campione con un laser TIRF e una sorgente luminosa LED IRM. Uno splitter di immagini commerciale modificato viene utilizzato per separare spettralmente i segnali TIRF e IRM e proiettarli su metà separate dello stesso chip della fotocamera. Impieghiamo anche un sistema microfluidico che consente il rapido scambio di reagenti durante l’imaging. Questo protocollo descrive come questa configurazione può essere utilizzata per l’immagine di microtubuli dinamici e MAP. La capacità dell’apparato è dimostrata presentando la prima visualizzazione delle proteine kinesin-1 che camminano su microtubuli restringenti, che viene catturata ad un frame rate di 10 s-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio della regolazione della dinamica dei microtubuli da parte delle proteine associate ai microtubuli (MAP) richiede spesso l’imaging simultaneo di microtubuli e MAP. Le tecniche di microscopia a fluorescenza come TIRF sono tipicamente impiegate per questo scopo. Tuttavia, sono limitati dagli svantaggi dell’imaging a fluorescenza, che includono fotosbiancamento, fotodanne e la necessità di etichettatura fluorofora. I metodi senza etichetta, come l’IRM, sono adatti per visualizzare i microtubuli ma non sono in grado di eseguire l’imaging di singoli fluorofori. Questo protocollo combina l’imaging IRM senza etichetta e la microscopia TIRF per l’imaging simultaneo di microtubuli dinamici e MAP.
La configurazione IRM utilizza una sorgente di illuminazione a LED filtrata a >600 nm, mentre la configurazione TIRF utilizza un laser a 488 nm. Abbiamo utilizzato uno splitter a fascio di piastre economico per riflettere la luce di illuminazione sul campione e trasmettere il segnale raccolto al rilevatore (Figura 1). È stato scelto uno splitter a fascio con il 10% di riflettanza e il 90% di trasmissione per ridurre al minimo la perdita del segnale a singola molecola. La perdita del 90% dell’intensità luminosa dell’illuminazione viene compensata aumentando la potenza del laser e del LED di illuminazione.
La separazione spettrale dei segnali è stata ottenuta utilizzando uno splitter a fascio 90/10 (R/T) e due filtri spettrali (long-pass 600 nm per IRM e band-pass 535/50 nm per TIRF). I segnali IRM e TIRF separati spettralmente vengono proiettati su due metà di un singolo chip della telecamera utilizzando un gruppo splitter di immagini. L’utilizzo di uno splitter a fascio 90/10 sacrifica il 90% del segnale IRM, ma questo viene compensato aumentando l’intensità della sorgente di illuminazione a LED. Uno specchio dicroico potrebbe anche essere utilizzato qui per separare i segnali IRM e TIRF in modo più efficiente. Le microsfere fluorescenti incluse nei test consentono un allineamento accurato delle immagini TIRF e IRM e fungono da riferimento per focalizzare l’obiettivo.
L’elemento ottico più critico in questo protocollo è l’obiettivo ad alta apertura numerica (NA). Questo è essenziale non solo per ottenere una riflessione interna totale, ma anche per massimizzare l’efficienza della collezione e il contrasto dell’immagine. La qualità delle immagini ottenute dipende anche dalla pulizia della superficie del vetro e dall’acquisizione di un’immagine di sfondo chiara per correggere l’illuminazione non uniforme e rimuovere le caratteristiche statiche. Per l’imaging IRM, si consiglia di utilizzare l’illuminazione a lunghezza d’onda lunga (>600 nm) per ridurre al minimo il fotodanno di microtubuli e proteine. Ciò è particolarmente importante se si utilizza una sorgente luminosa a LED bianca, nel qual caso è necessario includere un filtro passa-lungo per rimuovere la luce UV.
Questo protocollo consente l’imaging ad alta velocità senza etichette di microtubuli dinamici e la visualizzazione simultanea ad alta risoluzione di MAP fluorescenti17. Rispetto alla tecnica di commutazione del cubo del filtro, che alterna l’acquisizione di immagini di microtubuli e MAP, questa configurazione è in grado di frame rate molto più elevati perché non dipende dalla rotazione fisica di un cubo filtrante. Rispetto alle tecniche di imaging TIRF a due colori, questa tecnica impiega una configurazione ottica meno impegnativa ed elude la necessità di etichettare i microtubuli con fluorofori. Le principali limitazioni di questa configurazione sono dovute all’imaging TIRF delle MAP; il frame rate è limitato dal tempo di esposizione di un fluoroforo e la fotosbiancamento dei fluorofori rimane una possibilità. Tuttavia, questo protocollo migliora le tecniche esistenti perché utilizza TIRF solo quando necessario (cioè per visualizzare MAP ma non microtubuli) e raggiunge la massima velocità possibile entro i limiti di TIRF. Ulteriori miglioramenti sono possibili solo se sia i microtubuli che i MAP sono visualizzati tramite una tecnica interferometrica, ma ciò richiede l’etichettatura delle MAP con nanoparticelle metalliche, che ha i suoi limiti e sfide sperimentali.
Per dimostrare le capacità di questa tecnica, abbiamo visualizzato contemporaneamente due processi dinamici veloci tramite IRM e TIRF: il restringimento di un microtubulo e la camminata di una molecola di chinesina fluorescente. Questa tecnica è stata precedentemente impiegata per visualizzare la rapida diffusione della spastin sui microtubuli5 che si restringono. Oltre a questa applicazione a MAP e microtubuli, questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare singole molecole fluorescenti contemporaneamente a qualsiasi struttura macromolecolare abbastanza massiccia da essere visualizzata tramite IRM, come una membrana cellulare o un filamento di actina.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il laboratorio di Thierry Emonet per aver condiviso le attrezzature delle camere bianche. Ringraziamo Yin-Wei Kuo per aver preparato la eGFP-kinesin purificata utilizzata in questo studio. Y.T. riconosce il sostegno della Fondazione Alexander von Humboldt attraverso la Feodor Lynen Research Fellowship. Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant R01 GM139337 (a J.H.).
Materials
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
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