Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi
Summary
Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.
Abstract
Periferik sinirlerdeki mitokondriyal disfonksiyon, otoimmün hastalıklar, diyabet, enfeksiyonlar, kalıtsal bozukluklar ve tümörler dahil olmak üzere birçok nedenden dolayı tetiklenebilen periferik nöropati ile ilişkili çeşitli hastalıklara eşlik eder. Fare periferik sinirlerinde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, küçük örneklem büyüklüğü, dokuda bulunan sınırlı sayıda mitokondri ve bir miyelin kılıfının varlığı nedeniyle zor olabilir. Bu çalışmada açıklanan teknik, mitokondrileri dokudan izole etmek yerine siyatik sinir mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için kas lifleri için kullanılandan uyarlanmış benzersiz bir geçirgenlik protokolü kullanarak bu zorlukları en aza indirir. Amplex Red/Peroksidaz ile florimetrik reaktif tür üretimini ölçerek ve saponin-geçirgenleştirilmiş sinirlerdeki farklı mitokondriyal substratları ve inhibitörleri karşılaştırarak, mitokondriyal solunum durumlarını, reaktif oksijen türlerini (ROS) ve mitokondriyal komplekslerin aktivitesini aynı anda tespit etmek mümkün olmuştur. Bu nedenle, burada sunulan yöntem, mitokondriyal fonksiyonun diğer tekniklerle değerlendirilmesine kıyasla avantajlar sunmaktadır.
Introduction
Mitokondri, hücre canlılığını korumak için gereklidir ve enerji metabolizması (glikoz, amino asit, lipit ve nükleotid metabolizma yolları) gibi çok sayıda hücre fonksiyonunu yerine getirir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretiminin birincil yeri olan mitokondri, apoptoz gibi çeşitli hücre sinyal süreçlerinde merkezidir ve demir-kükürt (Fe-S) kümelerinin sentezine, mitokondriyal protein ithalatına ve olgunlaşmasına ve genomlarının ve ribozomlarının korunmasına katılır 1,2,3. Mitokondriyal membran dinamiği ağı, füzyon ve fisyon süreçleri tarafından kontrol edilir ve ayrıca kalite kontrol ve mitofi 4,5,6 için makinelere sahiptir.
Mitokondriyal disfonksiyon, kanser, diyabet ve obezite gibi çeşitli patolojik durumların ortaya çıkmasıyla ilişkilidir7. Mitokondriyal fonksiyondaki bozukluklar, Alzheimer hastalığı8,9, Parkinson hastalığı10,11, amiyotrofik lateral skleroz12,13 ve Huntington hastalığı 14,15’te olduğu gibi, merkezi sinir sistemini etkileyen nörodejeneratif bozukluklarda tespit edilir. . Periferik sinir sisteminde, Guillain-Barré sendromu 16,17 gibi immün nöropatilerde aksonlarda mitokondriyal fonksiyon kaybı gözlenir ve aksonlara yüksek mitokondriyal ROS üretimi ile birlikte, bu olaylar Schwann hücrelerinde MAP Kinaz aktivasyonuna yol açar18. Bu, mitokondriyal fizyolojinin sadece bölgeye özgü bir hücre için değil, tüm doku için gerekli olabileceğini göstermektedir. HIV ile ilişkili distal duyusal polinöropatide (HIV-DSP), mitokondri, transkriptasyon transaktivatörü (HIV-TAT) proteininin HIV’in etkili bir şekilde çoğalmasına izin verdiği mekanizmada ve HIV enfeksiyonu patogenezinde diğer birçok rolde rol oynamaktadır19,20.
Siyatik sinir mitokondriyal fizyolojisinin değerlendirilmesi, nöropatinin araştırılmasında temel bir hedef olarak ortaya çıkmıştır 7,21,22. Diyabetik nöropatide, proteomik ve metabolomik analizler, diyabetteki moleküler değişikliklerin çoğunun siyatik sinir mitokondriyal oksidatif fosforilasyonunu ve lipid metabolizmasını etkilediğini düşündürmektedir7. Bu değişiklikler aynı zamanda obeziteye bağlı diyabetin erken belirtileri gibi görünmektedir21. Kemoterapiye bağlı ağrılı nöropatinin bir fare modelinde, siyatik sinirdeki mitokondriyal bozulma, oksidatif fosforilasyon22’de bir azalma ve mitokondriyal komplekslerin aktivitelerinin, membran potansiyelinin ve ATP içeriğinin azalması olarak tespit edilir23. Bununla birlikte, birkaç grup nöropatilerde mitokondriyal disfonksiyondan bahsetmiş olsa da, bu çalışmalar mitokondriyal membranların korunmadığı, mitokondriyal bütünlüğün değerlendirilmesi veya mitokondriyal ATP üretimi için bir parametre olarak ATP içeriğinin ölçülmemesi ile mitokondriyal komplekslerdeki aktivite ölçümleri ile sınırlıdır. Genel olarak, mitokondriyal oksijen tüketiminin ve ROS üretiminin uygun bir değerlendirmesi, bir perkoll/sakkaroz gradyanında diferansiyel santrifüjleme ile mitokondrinin izolasyonunu gerektirir. Mitokondrinin izolasyonu, ihtiyaç duyulan büyük miktarda doku ve mitokondri kaybı ve bozulması nedeniyle siyatik sinir dokusu için sınırlayıcı bir faktör olabilir.
Bu çalışma, mitokondriyal fizyolojiyi siyatik sinirde mitokondriyal oksijen tüketimi ve ROS üretimi olarak ölçmek, mitokondriyal membranları korumak ve mitokondri izoline ihtiyaç duymadan ölçmek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş kas lifleri24’teki oksijen tüketimi ölçümlerinden yüksek çözünürlüklü respirometri (HRR) ile uyarlanmıştır. Bu prosedürün avantajları, siyatik sinir gibi az miktarda dokuda mitokondrinin değerlendirilmesi ve mitokondriyal parametrelerin in situ olarak değerlendirilmesi, böylece mitokondriyal ortamın, yapının ve biyoenerjetik profilin korunması, fizyolojik olarak güvenilir bir sonuç elde edilmesidir. Mitokondriyal solunum durumları, mitokondriyal membran bütünlüğü için mitokondriyal biyoenerjetik ve sitokrom c katsayısını doğru bir şekilde değerlendirmek için siyatik sinir geçirgenizasyonundan sonra substratlar ve inhibitörler ile belirlendi ve mitokondriyal elektron taşıma sisteminin (ETS) değerlendirilmesi ve temel parametrelerin hesaplanması adımları için bir rehber sağladı. Bu çalışma, periferik nöropatiler gibi siyatik sinir metabolizmasının rol oynadığı patofizyolojik mekanizmalardaki soruları cevaplamak için araçlar sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nöropatilere eşlik eden çeşitli hastalıklar veya durumlar risk faktörü olarak mitokondriyal disfonksiyona sahiptir. Periferik sinirlerde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, mitokondrinin bu nörodejeneratif koşullarda nasıl davrandığını aydınlatmak için gereklidir. Mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi, izolasyon yönteminin zorluğu ve malzeme kıtlığı nedeniyle zahmetlidir. Bu nedenle, mitokondri izolasyonunu gerektirmeyen doku geçirgenleştirme tekniklerinin geliştirilmesi esastır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) tarafından finanse edilmiştir. Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli ve Dr. Claudio Masuda’ya laboratuvar tesislerine verdikleri destek için ve Dr. Martha Sorenson’a makalenin geliştirilmesinde nazik ve değerli yorumları için minnettarız.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
