הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה
Summary
נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.
Abstract
תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בעצבים היקפיים מלווה מספר מחלות הקשורות לנוירופתיה היקפית, אשר יכולות להיות מופעלות על ידי גורמים מרובים, כולל מחלות אוטואימוניות, סוכרת, זיהומים, הפרעות תורשתיות וגידולים. הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצבים ההיקפיים של העכבר יכולה להיות מאתגרת בשל גודל המדגם הקטן, מספר מוגבל של מיטוכונדריה הנמצאת ברקמה, ונוכחותו של נדן מיאלין. הטכניקה המתוארת בעבודה זו ממזערת את האתגרים הללו על ידי שימוש בפרוטוקול חדירה ייחודי המותאם מאחד המשמש לסיבי שריר, כדי להעריך את תפקוד המיטוכונדריה העצבית הסיאטית במקום לבודד את המיטוכונדריה מהרקמה. על ידי מדידת ייצור מינים תגובתיים פלואורימטריים עם Amplex Red/Peroxidase והשוואת מצעים ומעכבים מיטוכונדריאליים שונים בעצבים מחלחלים של סאפונין, ניתן היה לזהות מצבי נשימה מיטוכונדריאליים, מיני חמצן תגובתי (ROS) ופעילות של קומפלקסים מיטוכונדריאליים בו זמנית. לכן, השיטה המוצגת כאן מציעה יתרונות בהשוואה להערכת תפקוד המיטוכונדריה על ידי טכניקות אחרות.
Introduction
המיטוכונדריה חיונית לשמירה על כדאיות התאים ומבצעת תפקודים תאיים רבים כגון חילוף חומרים של אנרגיה (גלוקוז, חומצת אמינו, שומנים ומסלולי חילוף חומרים של נוקלאוטידים). כאתר העיקרי לייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), המיטוכונדריה היא מרכזית במספר תהליכי איתות תאיים כגון אפופטוזיס ומשתתפת בסינתזה של צבירי ברזל-גופרית (Fe-S), ייבוא והבשלה של חלבונים מיטוכונדריאליים, ושמירה על הגנום והריבוזומים שלהם 1,2,3. רשת הדינמיקה של הממברנות המיטוכונדריה נשלטת על ידי תהליכי היתוך וביקוע, ויש להם גם מכונות לבקרת איכותומיטופגיה 4,5,6.
תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור להופעתם של מספר מצבים פתולוגיים כגון סרטן, סוכרת והשמנת יתר7. הפרעות בתפקוד המיטוכונדריה מזוהות בהפרעות נוירודגנרטיביות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כמו במחלת אלצהיימר 8,9, מחלת פרקינסון10,11, טרשת אמיוטרופית צידית12,13, ומחלת הנטינגטון14,15 . במערכת העצבים ההיקפית, אובדן תפקוד המיטוכונדריה באקסונים נצפה בנוירופתיה חיסונית, כגון תסמונת Guillain-Barré16,17, ובשילוב עם ייצור ROS מיטוכונדריאלי גבוה באקסונים, אירועים אלה מובילים להפעלת MAP Kinase בתאי שוואן18. זה מדגים כי פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית עשויה להיות חיונית לא רק עבור תא ספציפי לאתר, אלא עבור רקמה שלמה. בפולינוירופתיה חושית דיסטלית הקשורה ל- HIV (HIV-DSP), למיטוכונדריה יש תפקיד במנגנון שבאמצעותו הגורם הטרנס-מפעיל של חלבון שעתוק (HIV-TAT) מאפשר ל- HIV להשתכפל ביעילות, כמו גם מספר תפקידים אחרים בפתוגנזה של הידבקות ב- HIV19,20.
הערכה של פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית של עצבים סיאטיים התגלתה כמטרה חיונית לחקר נוירופתיה 7,21,22. בנוירופתיה סוכרתית, ניתוחים פרוטאומיים ומטבולומיים מצביעים על כך שרוב השינויים המולקולריים בסוכרת משפיעים על זרחון חמצון מיטוכונדריאלי של עצבים סיאטיים ועל חילוף החומרים של השומנים7. נראה כי שינויים אלה הם גם סימנים מוקדמים לסוכרת הנגרמת על ידי השמנת יתר21. במודל עכברי של נוירופתיה כואבת הנגרמת על ידי כימותרפיה, פגיעה מיטוכונדריאלית בעצב הסיאטי מזוהה כירידה בזרחון החמצוני22, והפחתה של פעילויות קומפלקסים מיטוכונדריאליים, פוטנציאל ממברנה ותכולת ATP23. עם זאת, למרות שכמה קבוצות ציינו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה בנוירופתיה, מחקרים אלה מוגבלים למדידות של פעילות בקומפלקסים מיטוכונדריאליים ללא שימור של הממברנות המיטוכונדריה, ללא הערכה של שלמות המיטוכונדריה או מדידות של תוכן ATP כפרמטר לייצור ATP מיטוכונדריאלי. באופן כללי, הערכה נכונה של צריכת חמצן מיטוכונדריאלי וייצור ROS דורשת בידוד של מיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית בשיפוע פרקול/סוכרוז. בידוד המיטוכונדריה יכול גם להיות גורם מגביל לרקמת עצב סיאטית בגלל הכמות הגדולה של הרקמה הדרושה ואובדן מיטוכונדריה והפרעה.
המחקר הנוכחי נועד לספק פרוטוקול למדידת הפיזיולוגיה המיטוכונדרית כצריכה חמצן מיטוכונדריאלית וייצור ROS בעצב הסיאטי, תוך שמירה על ממברנות מיטוכונדריאליות וללא צורך בבידוד המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מותאם ממדידות צריכת חמצן בסיבי שריר חודרניים24 על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה (HRR). היתרונות של הליך זה הם האפשרות להעריך את המיטוכונדריה בכמויות קטנות של רקמות כגון העצב הסיאטי ולהעריך פרמטרים מיטוכונדריאליים באתרם, ובכך לשמר את הסביבה המיטוכונדרית, המבנה והפרופיל הביו-אנרגטי, כדי להשיג תוצאה אמינה מבחינה פיזיולוגית. מצבי הנשימה המיטוכונדריים נקבעו עם מצעים ומעכבים לאחר חדירת עצבים סיאטיים כדי להעריך כראוי ביו-אנרגיה מיטוכונדריאלית ומקדם ציטוכרום c לשלמות הממברנה המיטוכונדרית, וסיפקו מדריך לצעדים של הערכת מערכת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETS) וחישוב פרמטרים חיוניים. מחקר זה יכול לספק כלים למענה על שאלות במנגנונים פתופיזיולוגיים שבהם מעורב חילוף החומרים העצבי הסיאטי, כגון נוירופתיות היקפיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר מחלות או מצבים המלווים נוירופתיות סובלים מתפקוד לקוי של המיטוכונדריה כגורם סיכון. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה בעצבים היקפיים חיונית כדי להבהיר כיצד המיטוכונדריה פועלת במצבים נוירודגנרטיביים אלה. ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה היא מייגעת בשל הקושי של שיטת הבידוד והמחסור בחומר. לפיכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מכון סראפילהירה, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) ו-Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). אנו מודים לד”ר אנטוניו גלינה פילו, לד”ר מוניקה מונטרו לומלי ולד”ר קלאודיו מסודה על התמיכה במתקני המעבדה, ולד”ר מרתה סורנסון על הערות טובות ובעלות ערך בשיפור המאמר.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
