Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Mitocôndrias são essenciais para manter a viabilidade celular e desempenham inúmeras funções celulares, como metabolismo energético (glicose, aminoácido, lipídio e metabolismo de nucleotídeos). Como local principal da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), as mitocôndrias são centrais em diversos processos de sinalização celular, como apoptose e participam da síntese de aglomerados de ferro-enxofre (Fe-S), importação e maturação de proteínas mitocondriais, e manutenção de seu genoma e ribossomos ^1,2,3. A rede de dinâmica da membrana mitocondrial é controlada por processos de fusão e fissão, e também possui máquinas para controle de qualidade e mitofagia ^4,5,6.

A disfunção mitocondrial está associada ao aparecimento de várias condições patológicas, como câncer, diabetes e obesidade⁷. Distúrbios na função mitocondrial são detectados em distúrbios neurodegenerativos que afetam o sistema nervoso central, como na doença de Alzheimer ^8,9, doença de Parkinson^10,11, esclerose lateral amiotrófica^12,13 e doença de Huntington^14,15 . No sistema nervoso periférico, a perda da função mitocondrial em axônios é observada em neuropatias imunológicas, como a síndrome de Guillain-Barré^16,17, e em associação com a alta produção de ROS mitocondrial em axônios, esses eventos levam à ativação do MAP Kinase em células schwann¹⁸. Isso demonstra que a fisiologia mitocondrial pode ser essencial não apenas para uma célula específica do local, mas para um tecido inteiro. Na polineuuropatia sensorial distal associada ao HIV (HIV-DSP), as mitocôndrias têm um papel no mecanismo pelo qual o trans-ativador da proteína de transcrição (HIV-TAT) permite que o HIV se replique eficientemente, bem como vários outros papéis na patogênese de infecção pelo HIV^19,20.

A avaliação da fisiologia mitocondrial do nervo ciático emergiu como um alvo essencial para investigar a neuropatia ^7,21,22. Na neuropatia diabética, análises proteômicas e metabolômicas sugerem que a maioria das alterações moleculares no diabetes afetam a fosforilação oxidativa do nervo ciático e o metabolismo lipídico⁷. Essas alterações também parecem ser sinais precoces de diabetes induzido pela obesidade²¹. Em um modelo de camundongos de neuropatia dolorosa induzida pela quimioterapia, o comprometimento mitocondrial no nervo ciático é detectado como uma diminuição na fosforilação oxidativa²², e uma redução das atividades de complexos mitocondriais, potencial de membrana e conteúdo ATP²³. No entanto, embora vários grupos tenham citado disfunção mitocondrial em neuropatias, esses estudos estão limitados às medições de atividade em complexos mitocondriais sem preservação das membranas mitocondriais, sem avaliação da integridade mitocondrial ou medições de conteúdo ATP como parâmetro para a produção mitocondrial da ATP. Em geral, uma avaliação adequada do consumo mitocondrial de oxigênio e da produção de ROS requer o isolamento das mitocôndrias por centrifugação diferencial em um gradiente percoll/sacarose. O isolamento das mitocôndrias também pode ser um fator limitante para o tecido nervoso ciático devido à grande quantidade de tecido necessário e à perda e perturbação das mitocôndrias.

O presente estudo tem como objetivo fornecer um protocolo para medir a fisiologia mitocondrial como consumo mitocondrial de oxigênio e produção de ROS no nervo ciático, preservando membranas mitocondriais e sem a necessidade de isolar mitocôndrias. Este protocolo é adaptado a partir de medidas de consumo de oxigênio em fibras musculares permeabilizadas²⁴ por respirometria de alta resolução (HRR). As vantagens desse procedimento são a possibilidade de avaliar mitocôndrias em pequenas quantidades de tecido, como o nervo ciático e avaliar parâmetros mitocondriais in situ, preservando assim o ambiente mitocondrial, estrutura e perfil bioenergésico, para obter um resultado fisiologicamente confiável. Os estados respiratórios mitocondriais foram determinados com substratos e inibidores após a permeabilização do nervo ciático para avaliar adequadamente o bioenergetics mitocondrial e o coeficiente c citocromo para a integridade da membrana mitocondrial, fornecendo um guia para etapas da avaliação do sistema de transporte eletrônico mitocondrial (ETS) e cálculo de parâmetros essenciais. Este estudo pode fornecer ferramentas para responder a perguntas em mecanismos fisiopatológicos nos quais o metabolismo do nervo ciático está implicado, como neuropatias periféricas.