تقييم وظيفة الميتوكوندريا في العصب الوركي عن طريق قياس التنفس عالي الدقة
Summary
يحدد قياس التنفس عالي الدقة إلى جانب مستشعرات التألق استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). يصف هذا البروتوكول تقنية لتقييم معدلات التنفس الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي المتغلغل.
Abstract
يصاحب خلل الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية العديد من الأمراض المرتبطة بالاعتلال العصبي المحيطي ، والذي يمكن أن يحدث لأسباب متعددة ، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية والسكري والالتهابات والاضطرابات الموروثة والأورام. يمكن أن يكون تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية للفأر أمرا صعبا بسبب صغر حجم العينة ، وعدد محدود من الميتوكوندريا الموجودة في الأنسجة ، ووجود غمد المايلين. تقلل التقنية الموصوفة في هذا العمل من هذه التحديات باستخدام بروتوكول نفاذية فريد من نوعه مقتبس من بروتوكول يستخدم لألياف العضلات ، لتقييم وظيفة الميتوكوندريا العصبية الوركية بدلا من عزل الميتوكوندريا عن الأنسجة. من خلال قياس إنتاج الأنواع التفاعلية الفلورية باستخدام Amplex Red / Peroxidase ومقارنة ركائز ومثبطات الميتوكوندريا المختلفة في الأعصاب النفاذة للسابونين ، كان من الممكن اكتشاف حالات الجهاز التنفسي للميتوكوندريا ، وأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، ونشاط مجمعات الميتوكوندريا في وقت واحد. لذلك ، فإن الطريقة المعروضة هنا تقدم مزايا مقارنة بتقييم وظيفة الميتوكوندريا بواسطة تقنيات أخرى.
Introduction
الميتوكوندريا ضرورية للحفاظ على صلاحية الخلية وأداء العديد من وظائف الخلية مثل استقلاب الطاقة (الجلوكوز والأحماض الأمينية والدهون ومسارات استقلاب النيوكليوتيدات). باعتبارها الموقع الرئيسي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، فإن الميتوكوندريا مركزية في العديد من عمليات إشارات الخلايا مثل موت الخلايا المبرمج وتشارك في تخليق مجموعات الحديد والكبريت (Fe-S) ، واستيراد بروتين الميتوكوندريا ونضجه ، والحفاظ على الجينوم والريبوسومات1،2،3. يتم التحكم في شبكة ديناميكيات غشاء الميتوكوندريا عن طريق عمليات الاندماج والانشطار ، ولديهم أيضا آلات لمراقبة الجودة و mitophagy 4,5,6.
يرتبط خلل الميتوكوندريا بظهور العديد من الحالات المرضية مثل السرطان والسكري والسمنة7. يتم الكشف عن اضطرابات في وظيفة الميتوكوندريا في الاضطرابات العصبية التنكسية التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي ، كما هو الحال في مرض الزهايمر 8,9 ، ومرض باركنسون 10,11 ، والتصلب الجانبي الضموري 12,13 ، ومرض هنتنغتون 14,15 . في الجهاز العصبي المحيطي ، لوحظ فقدان وظيفة الميتوكوندريا في المحاور العصبية في الاعتلالات العصبية المناعية ، مثل متلازمة غيلان باريه 16,17 ، وبالاقتران مع ارتفاع إنتاج ROS الميتوكوندريا في المحاور العصبية ، تؤدي هذه الأحداث إلى تنشيط كيناز MAP في خلايا شوان18. هذا يدل على أن فسيولوجيا الميتوكوندريا قد تكون ضرورية ليس فقط لخلية خاصة بالموقع ، ولكن لنسيج بأكمله. في اعتلال الأعصاب الحسي البعيد المرتبط بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV-DSP) ، يكون للميتوكوندريا دور في الآلية التي يسمح من خلالها المنشط العابر لبروتين النسخ (HIV-TAT) لفيروس نقص المناعة البشرية بالتكاثر بكفاءة ، بالإضافة إلى العديد من الأدوار الأخرى في التسبب في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية19,20.
ظهر تقييم فسيولوجيا الميتوكوندريا العصبية الوركية كهدف أساسي للتحقيق في الاعتلال العصبي7،21،22. في الاعتلال العصبي السكري ، تشير التحليلات البروتينية والأيضية إلى أن معظم التغيرات الجزيئية في مرض السكري تؤثر على الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا الوركية للعصب الوركي واستقلاب الدهون7. يبدو أن هذه التعديلات هي أيضا علامات مبكرة لمرض السكري الناجم عن السمنة21. في نموذج الفأر للاعتلال العصبي المؤلم الناجم عن العلاج الكيميائي ، يتم الكشف عن ضعف الميتوكوندريا في العصب الوركي كانخفاض في الفسفرة التأكسدية22 ، وانخفاض في أنشطة مجمعات الميتوكوندريا ، وإمكانات الغشاء ، ومحتوى ATP23. ومع ذلك ، على الرغم من أن العديد من المجموعات قد استشهدت بخلل الميتوكوندريا في الاعتلالات العصبية ، إلا أن هذه الدراسات تقتصر على قياسات النشاط في مجمعات الميتوكوندريا دون الحفاظ على أغشية الميتوكوندريا ، وتفتقر إلى تقييم سلامة الميتوكوندريا أو قياسات محتوى ATP كمعلمة لإنتاج ATP الميتوكوندريا. بشكل عام ، يتطلب التقييم السليم لاستهلاك أكسجين الميتوكوندريا وإنتاج ROS عزل الميتوكوندريا عن طريق الطرد المركزي التفاضلي في تدرج percoll / sucrose. يمكن أن يكون عزل الميتوكوندريا أيضا عاملا مقيدا للأنسجة العصبية الوركية بسبب الكمية الكبيرة من الأنسجة اللازمة وفقدان الميتوكوندريا وتعطيلها.
تهدف هذه الدراسة إلى توفير بروتوكول لقياس فسيولوجيا الميتوكوندريا مثل استهلاك أكسجين الميتوكوندريا وإنتاج ROS في العصب الوركي ، والحفاظ على أغشية الميتوكوندريا ودون الحاجة إلى عزل الميتوكوندريا. تم تكييف هذا البروتوكول من قياسات استهلاك الأكسجين في ألياف العضلات المتخلل24 بواسطة قياس التنفس عالي الدقة (HRR). تتمثل مزايا هذا الإجراء في إمكانية تقييم الميتوكوندريا في كميات صغيرة من الأنسجة مثل العصب الوركي وتقييم معلمات الميتوكوندريا في الموقع ، وبالتالي الحفاظ على بيئة الميتوكوندريا وهيكلها وملف تعريف الطاقة الحيوية ، للحصول على نتيجة جديرة بالثقة من الناحية الفسيولوجية. تم تحديد الحالات التنفسية للميتوكوندريا باستخدام ركائز ومثبطات بعد نفاذية العصب الوركي لتقييم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ومعامل السيتوكروم ج بشكل صحيح لسلامة غشاء الميتوكوندريا ، مما يوفر دليلا لخطوات تقييم نظام نقل إلكترون الميتوكوندريا (ETS) وحساب المعلمات الأساسية. يمكن أن توفر هذه الدراسة أدوات للإجابة على الأسئلة في الآليات الفسيولوجية المرضية التي يتورط فيها استقلاب العصب الوركي ، مثل الاعتلالات العصبية المحيطية.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الأمراض أو الحالات المصاحبة للاعتلالات العصبية لديها خلل وظيفي في الميتوكوندريا كعامل خطر. يعد تقييم وظيفة الميتوكوندريا في الأعصاب الطرفية أمرا ضروريا لتوضيح كيفية عمل الميتوكوندريا في هذه الحالات التنكسية العصبية. تقييم وظيفة الميتوكوندريا شاق بسبب صعوبة طريقة العزل وندرة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد مول هذه الدراسة كل من المعهد السريبيليهيرا، ومؤسسة إنفاذ الحقوق الدستورية في ريو دي جانيرو، والمجلس الوطني للتنمية المدنية والتكنولوجية (CNPq)، وتنسيقية الأعمال الصديقة للفيزياء في نيفيل العليا – البرازيل. نحن ممتنون للدكتور أنطونيو غالينا فيلهو والدكتورة مونيكا مونتيرو لوميلي والدكتور كلاوديو ماسودا على الدعم مع مرافق المختبر ، والدكتورة مارثا سورنسون على التعليقات اللطيفة والقيمة في تحسين المقالة.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
