Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie
Summary
Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.
Abstract
Mitochondriale disfunctie in perifere zenuwen gaat gepaard met verschillende ziekten geassocieerd met perifere neuropathie, die kan worden veroorzaakt door meerdere oorzaken, waaronder auto-immuunziekten, diabetes, infecties, erfelijke aandoeningen en tumoren. Het beoordelen van de mitochondriale functie in perifere zenuwen van muizen kan een uitdaging zijn vanwege de kleine steekproefomvang, een beperkt aantal mitochondriën in het weefsel en de aanwezigheid van een myelineschede. De techniek die in dit werk wordt beschreven, minimaliseert deze uitdagingen door een uniek permeabilisatieprotocol te gebruiken dat is aangepast aan een protocol dat wordt gebruikt voor spiervezels, om de mitochondriale functie van de heupzenuw te beoordelen in plaats van de mitochondriën uit het weefsel te isoleren. Door de productie van fluorimetrische reactieve soorten te meten met Amplex Red / Peroxidase en verschillende mitochondriale substraten en remmers in saponine-permeabilized zenuwen te vergelijken, was het mogelijk om mitochondriale ademhalingstoestanden, reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de activiteit van mitochondriale complexen tegelijkertijd te detecteren. Daarom biedt de hier gepresenteerde methode voordelen in vergelijking met de beoordeling van de mitochondriale functie door andere technieken.
Introduction
Mitochondriën zijn essentieel voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen en voeren tal van celfuncties uit, zoals energiemetabolisme (glucose-, aminozuur-, lipide- en nucleotidemetabolismeroutes). Als de primaire plaats van productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), staan mitochondriën centraal in verschillende celsignaleringsprocessen zoals apoptose en nemen ze deel aan de synthese van ijzer-zwavel (Fe-S) clusters, mitochondriale eiwitimport en -rijping, en onderhoud van hun genoom en ribosomen 1,2,3. Het mitochondriale membraandynamicanetwerk wordt gecontroleerd door fusie- en splijtingsprocessen en ze hebben ook machines voor kwaliteitscontrole en mitofagie 4,5,6.
Mitochondriale disfunctie wordt geassocieerd met het verschijnen van verschillende pathologische aandoeningen zoals kanker, diabetes en obesitas7. Verstoringen in de mitochondriale functie worden gedetecteerd bij neurodegeneratieve aandoeningen die het centrale zenuwstelsel aantasten, zoals bij de ziekte van Alzheimer 8,9, de ziekte van Parkinson10,11, amyotrofische laterale sclerose12,13 en de ziekte van Huntington14,15 . In het perifere zenuwstelsel wordt verlies van mitochondriale functie in axonen waargenomen bij immuunneuropathieën, zoals Guillain-Barré-syndroom16,17, en in combinatie met een hoge mitochondriale ROS-productie in axonen leiden deze gebeurtenissen tot MAP Kinase-activering in Schwann-cellen18. Dit toont aan dat mitochondriale fysiologie niet alleen essentieel kan zijn voor een plaatsspecifieke cel, maar voor een heel weefsel. Bij HIV-geassocieerde distale sensorische polyneuropathie (HIV-DSP) spelen mitochondriën een rol in het mechanisme waarmee het trans-activator van transcriptie (HIV-TAT) eiwit HIV in staat stelt zich efficiënt te repliceren, evenals verschillende andere rollen in hiv-infectie pathogenese19,20.
Evaluatie van de mitochondriale fysiologie van de heupzenuw is naar voren gekomen als een essentieel doelwit voor het onderzoeken van neuropathie 7,21,22. Bij diabetische neuropathie suggereren proteomische en metabolomische analyses dat de meeste moleculaire veranderingen in diabetes de mitochondriale oxidatieve fosforylering van de heupzenuw en het lipidenmetabolisme beïnvloeden7. Deze veranderingen lijken ook vroege tekenen te zijn van door obesitas veroorzaakte diabetes21. In een muismodel van door chemotherapie geïnduceerde pijnlijke neuropathie wordt mitochondriale stoornissen in de heupzenuw gedetecteerd als een afname van oxidatieve fosforylering22 en een vermindering van mitochondriale complexenactiviteiten, membraanpotentiaal en ATP-gehalte23. Hoewel verschillende groepen mitochondriale disfunctie in neuropathieën hebben aangehaald, zijn deze studies beperkt tot de metingen van activiteit in mitochondriale complexen zonder behoud van de mitochondriale membranen, zonder evaluatie van mitochondriale integriteit of metingen van ATP-inhoud als parameter voor mitochondriale ATP-productie. Over het algemeen vereist een goede beoordeling van mitochondriaal zuurstofverbruik en ROS-productie de isolatie van mitochondriën door differentiële centrifugatie in een percoll / sucrosegradiënt. Isolatie van mitochondriën kan ook een beperkende factor zijn voor ischiaszenuwweefsel vanwege de grote hoeveelheid weefsel die nodig is en mitochondriaal verlies en verstoring.
De huidige studie heeft tot doel een protocol te bieden om mitochondriale fysiologie te meten als mitochondriaal zuurstofverbruik en ROS-productie in de heupzenuw, met behoud van mitochondriale membranen en zonder de noodzaak van isolerende mitochondriën. Dit protocol is aangepast van zuurstofverbruiksmetingen in gepermeabiliseerde spiervezels24 door middel van hoge resolutie respirometrie (HRR). De voordelen van deze procedure zijn de mogelijkheid om mitochondriën in kleine hoeveelheden weefsel zoals de heupzenuw te evalueren en mitochondriale parameters in situ te evalueren, waardoor de mitochondriale omgeving, structuur en bio-energetisch profiel behouden blijven, om een fysiologisch betrouwbaar resultaat te verkrijgen. De mitochondriale ademhalingstoestanden werden bepaald met substraten en remmers na ischiaszenuwpermeabilisatie om mitochondriale bio-energetica en cytochroom c-coëfficiënt voor mitochondriale membraanintegriteit goed te beoordelen, wat een gids biedt voor stappen van de mitochondriale elektronentransportsysteem (ETS) evaluatie en berekening van essentiële parameters. Deze studie kan hulpmiddelen bieden voor het beantwoorden van vragen in pathofysiologische mechanismen waarbij het metabolisme van de heupzenuw betrokken is, zoals perifere neuropathieën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende ziekten of aandoeningen die gepaard gaan met neuropathieën hebben mitochondriale disfunctie als risicofactor. De evaluatie van de mitochondriale functie in perifere zenuwen is essentieel om op te helderen hoe de mitochondriën werken in deze neurodegeneratieve aandoeningen. De beoordeling van de mitochondriale functie is bewerkelijk vanwege de moeilijkheid van de isolatiemethode en de schaarste aan materiaal. De ontwikkeling van weefselpermeabilisatietechnieken die geen isolatie van mitochondriën vereisen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). We zijn Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli en Dr. Claudio Masuda dankbaar voor de ondersteuning met laboratoriumfaciliteiten, en Dr. Martha Sorenson voor vriendelijke en waardevolle opmerkingen bij het verbeteren van het artikel.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
References
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
