Оценка митохондриальной функции в седалищном нерве с помощью респирометрии высокого разрешения

Митохондрии необходимы для поддержания жизнеспособности клеток и выполняют многочисленные клеточные функции, такие как энергетический метаболизм (пути метаболизма глюкозы, аминокислот, липидов и нуклеотидов). Как основной участок производства активных форм кислорода (АФК), митохондрии занимают центральное место в нескольких клеточных сигнальных процессах, таких как апоптоз, и участвуют в синтезе железо-серных (Fe-S) кластеров, импорте и созревании митохондриального белка и поддержании их генома и рибосом ^1,2,3. Сеть динамики митохондриальных мембран контролируется процессами слияния и деления, а также имеет механизм контроля качества и митофагии ^4,5,6.

Митохондриальная дисфункция связана с появлением нескольких патологических состояний, таких как рак, диабет и ожирение⁷. Нарушения митохондриальной функции выявляются при нейродегенеративных расстройствах, влияющих на центральную нервную систему, таких как болезнь Альцгеймера ^8,9, болезнь Паркинсона^10,11, боковой амиотрофический склероз^12,13 и болезнь Хантингтона^14,15 . В периферической нервной системе потеря митохондриальной функции в аксонах наблюдается при иммунных невропатиях, таких как синдром Гийена-Барре^16,17, и в связи с высокой митохондриальной продукцией АФК в аксонах эти события приводят к активации MAP киназы в шванновских клетках¹⁸. Это демонстрирует, что митохондриальная физиология может быть необходима не только для клетки, специфичной для сайта, но и для всей ткани. При ВИЧ-ассоциированной дистальной сенсорной полинейропатии (ВИЧ-ДСП) митохондрии играют роль в механизме, с помощью которого трансактиватор транскрипционного белка (ВИЧ-ТАТ) позволяет ВИЧ эффективно реплицироваться, а также ряд других ролей в патогенезе ВИЧ-инфекции^19,20.

Оценка физиологии митохондрий седалищного нерва стала важной целью для исследования нейропатии ^7,21,22. При диабетической нейропатии протеомный и метаболомный анализы показывают, что большинство молекулярных изменений при диабете влияют на митохондриальное окислительное фосфорилирование седалищного нерва и липидный обмен⁷. Эти изменения также, по-видимому, являются ранними признаками диабета²¹, вызванного ожирением. В мышиной модели вызванной химиотерапией болезненной нейропатии митохондриальные нарушения в седалищном нерве обнаруживаются как снижение окислительного фосфорилирования²² и снижение активности митохондриальных комплексов, мембранного потенциала и содержания АТФ²³. Однако, хотя несколько групп ссылались на митохондриальную дисфункцию при невропатиях, эти исследования ограничены измерениями активности в митохондриальных комплексах без сохранения митохондриальных мембран, без оценки целостности митохондрий или измерений содержания АТФ в качестве параметра для митохондриальной продукции АТФ. В целом, правильная оценка потребления митохондриального кислорода и производства АФК требует выделения митохондрий путем дифференциального центрифугирования в градиенте перколл/сахарозы. Выделение митохондрий также может быть ограничивающим фактором для ткани седалищного нерва из-за большого количества необходимой ткани и потери и разрушения митохондрий.

Настоящее исследование направлено на обеспечение протокола для измерения митохондриальной физиологии как потребления митохондриального кислорода и производства АФК в седалищном нерве, сохраняя митохондриальные мембраны и без необходимости выделения митохондрий. Этот протокол адаптирован из измерений потребления кислорода в пермеабилизированных мышечных волокнах²⁴ с помощью респирометрии высокого разрешения (HRR). Преимуществами этой процедуры являются возможность оценки митохондрий в небольших количествах ткани, таких как седалищный нерв, и оценка митохондриальных параметров in situ, тем самым сохраняя митохондриальную среду, структуру и биоэнергетический профиль, для получения физиологически достоверного результата. Митохондриальные респираторные состояния определяли с помощью субстратов и ингибиторов после пермеабилизации седалищного нерва для правильной оценки митохондриальной биоэнергетики и коэффициента цитохрома C для целостности митохондриальной мембраны, обеспечивая руководство для этапов оценки митохондриальной электронной транспортной системы (ETS) и расчета существенных параметров. Это исследование может предоставить инструменты для ответа на вопросы в патофизиологических механизмах, в которых участвует метаболизм седалищного нерва, таких как периферические невропатии.