Pozitif Anlamlı RNA Virüsü Varyantlarını Tasarlamak için Tersine Genetik
Summary
Protokol, hataya açık PCR ve ters genetik kullanarak tam uzunlukta mutant RNA sentezini birleştirerek hepatit C virüsü genomunda kontrol edilebilir genetik çeşitliliği tanıtmak için bir yöntemi açıklar. Yöntem, fenotip seçimi için bir model sağlar ve 10 kb uzunluğunda pozitif anlamlı RNA virüs genomları için kullanılabilir.
Abstract
Çeşitli tam uzunlukta viral varyantların yinelemeli üretimi için uygun bir yöntemin olmaması, RNA virüslerinde yönlendirilmiş evrim çalışmasını engellemiştir. Tam bir RNA genomu hataya eğilimli PCR ve ters genetiği entegre ederek, rastgele genom çapında ikame mutajenezi indüklenebilir. İlgilenilen fenotiplere sahip viral mutantları tanımlamak için çeşitli kütüphaneleri sentezlemek için bu tekniği kullanan bir yöntem geliştirdik. Tam uzunlukta mutant RNA sentezi (FL-MRS) olarak adlandırılan bu yöntem aşağıdaki avantajları sunar: (i) yüksek verimli, tek adımlı hataya eğilimli bir PCR aracılığıyla büyük bir kütüphane oluşturma yeteneği; (ii) DNA polimerazın aslına uygunluğunu manipüle ederek farklı seviyelerde genetik çeşitliliğe sahip kütüphane grupları oluşturma yeteneği; (iii) mutant RNA sentezi için doğrudan bir şablon görevi görebilecek tam uzunlukta bir PCR ürününün oluşturulması; ve (iv) istenen fenotipteki viral mutantları taramak için seçilmemiş bir girdi havuzu olarak konakçı hücrelere iletilebilen RNA oluşturma yeteneği. Ters genetik bir yaklaşım kullanarak, FL-MRS’nin hepatit C virüsü, JFH1 izolatının yaşam döngüsünün tüm aşamalarında viral yönelimli evrimi incelemek için güvenilir bir araç olduğunu bulduk. Bu teknik, pozitif anlamlı RNA virüslerinde adaptasyon, replikasyon ve viral genlerin patogenez ve antiviral dirençteki rolünü anlamak için yönlendirilmiş evrimi kullanmak için paha biçilmez bir araç gibi görünmektedir.
Introduction
İleri genetik tarama, ilgilenilen viral bir fenotiple başlar ve daha sonra genomunu dizileyerek ve orijinal suşunkiyle karşılaştırarak, bu fenotipe neden olan mutasyonları tanımlamaya çalışır. Buna karşılık, ters genetik taramalarda, bir hedef gende rastgele mutasyonlar ortaya çıkar ve ardından ortaya çıkan fenotip(ler)in incelenmesi sağlanır1. Ters genetik yaklaşımı için, in vitro mutajenez, daha sonra ilgilenilen fenotipler için taranan bir varyant havuzu oluşturmak için en yaygın kullanılan tekniktir. Hataya eğilimli PCR (ep-PCR)2,3, dairesel polimeraz uzantısı 4 ve Mu-transpozon ekleme mutajenezi 5,6,7 dahil olmak üzere RNA virüslerinin genom çapında rastgele mutajenezini elde etmek için çeşitli genetik araçlar bildirilmiştir. Son iki yöntem, sınırlı dizi çeşitliliği barındıran kütüphaneler sağlar ve virüsler için oldukça öldürücü olan ve bulaşıcı viral varyantların iyileşmesini ciddi şekilde sınırlayan büyük ekleme ve silmelerin ortaya çıkmasına eğilimlidir.
ep-PCR, gelişmiş termal stabilite, substrat özgüllüğü ve katalitik aktivitegibi istenen özelliklere sahip fenotiplerin seçimi için mutant enzimler üretmek üzere protein mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan iyi bilinen güçlü bir mutajenez tekniğidir 8,9,10. Bu tekniğin uygulanması kolaydır çünkü basit ekipman gerektirir, sıkıcı manipülasyonlar içermez, piyasada bulunan reaktifleri kullanır ve hızlıdır; Ayrıca, yüksek kaliteli kütüphaneler oluşturur.
Burada, rastgele genom çapında ikame mutajenezi ve ters genetiği indükleyen ep-PCR’yi entegre ederek hepatit C virüsünün (HCV) tam genomlarını oluşturmak için tam uzunlukta mutant RNA sentezi (FL-MRS) için yeni bir yöntem geliştirdik. Tek bir nükleotid eklenmesi veya silinmesi bile pozitif anlamlı RNA virüsleri ([+]ssRNA) için oldukça zararlıdır; bu nedenle, PCR tabanlı ikame mutajenezi, iyi canlılığa sahip tam (+)ss RNA virüsü genomlarının büyük, çeşitli kütüphanelerinin yinelemeli üretimi için tercih edilen yöntemdir.
FL-MRS, viral cDNA klonuna bağlanan bir primer setinin titiz tasarımı yoluyla ~10 kb genom uzunluğuna sahip herhangi bir pozitif anlamlı RNA virüsüne uygulanabilen basit bir yaklaşımdır. pJFH1, HCV genotip 2a’yı kodlayan ve virüs yaşam döngüsünün tüm adımlarını özetleyebilen bulaşıcı bir cDNA klonudur. FL-MRS yaklaşımını kullanarak, mutasyonlarla ilişkili özellikler hakkında önceden bilgi sahibi olmayan, replikasyona yetkin JFH1 varyantları üretmek için rastgele mutajenize edilmiş tam genom kütüphanelerinin (mutant kütüphaneler [ML’ler]) sentezini gösterdik. Bir antiviral’e maruz kaldıktan sonra, bazı viral varyantlar, istenen fenotipik değişiklikle ilaç baskısının üstesinden hızla geldi. Burada açıklanan protokol kullanılarak, (+)ssRNA virüslerinin evrimini incelemek için fırsatlar yaratan çok sayıda viral varyant oluşturulabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, HCV tam genom kütüphanelerini sentezlemek için ep-PCR18 ve ters genetiği entegre eden basit ve hızlı bir FL-MRS prosedürünü detaylandırdık ve daha sonra ilaca dirençli fenotiplerin taranması için replikasyona yetkin varyantlar oluşturmak için bir hücre kültürü sisteminde kullanılabilir. Düşük kaliteli Taq DNA polimerazın kullanımı, tam uzunlukta bir viral genomun PCR amplifikasyonu sırasında ikamelerin dahil edilmesine izin veren ep-PCR’nin bir ön ko?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma için finansman desteği (hibe numarası BT/PR10906/MED/29/860/2014) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü tarafından sağlanmıştır.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -. J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
