Genética reversa para projetar variantes do vírus de RNA de sentido positivo
Summary
O protocolo descreve um método para introduzir diversidade genética controlável no genoma do vírus da hepatite C combinando síntese completa de RNA mutante usando PCR propenso a erros e genética reversa. O método fornece um modelo para seleção de fenótipos e pode ser usado para genomas de vírus de RNA de sentido positivo de 10 kb longos.
Abstract
A falta de um método conveniente para a geração iterativa de diversas variantes virais de comprimento total tem impedido o estudo da evolução dirigida em vírus de RNA. Ao integrar uma PCR propensa a erros no genoma de RNA e genética reversa, a mutagênese de substituição aleatória do genoma pode ser induzida. Desenvolvemos um método usando esta técnica para sintetizar diversas bibliotecas para identificar mutantes virais com fenótipos de interesse. Esse método, chamado síntese completa de RNA mutante (FL-MRS), oferece as seguintes vantagens: (i) a capacidade de criar uma grande biblioteca por meio de uma PCR altamente eficiente e propensa a erros em uma etapa; (ii) a capacidade de criar grupos de bibliotecas com diferentes níveis de diversidade genética, manipulando a fidelidade da DNA polimerase; (iii) a criação de um produto de PCR completo que possa servir diretamente como um modelo para a síntese de RNA mutante; e (iv) a capacidade de criar RNA que pode ser entregue em células hospedeiras como um pool de entrada não selecionado para rastrear mutantes virais do fenótipo desejado. Descobrimos, usando uma abordagem de genética reversa, que a ERM-FL é uma ferramenta confiável para estudar a evolução dirigida por vírus em todos os estágios do ciclo de vida do vírus da hepatite C, isolado de JFH1. Esta técnica parece ser uma ferramenta inestimável para empregar a evolução dirigida para entender a adaptação, a replicação e o papel dos genes virais na patogênese e resistência antiviral em vírus de RNA de sentido positivo.
Introduction
O rastreamento genético antecipado começa com um fenótipo viral de interesse e, em seguida, por meio do sequenciamento de seu genoma e comparação com o da cepa original, tenta identificar a(s) mutação(ões) causadora(s) desse fenótipo. Em contraste, nos rastreamentos genéticos reversos, mutações aleatórias são introduzidas em um gene alvo, seguidas por um exame do(s) fenótipo(s) resultante(s)1. Para a abordagem da genética reversa, a mutagênese in vitro é a técnica mais amplamente utilizada para criar um pool de variantes que são posteriormente rastreadas para fenótipos de interesse. Várias ferramentas genéticas têm sido relatadas para a obtenção de mutagênese aleatória genômica de vírus de RNA, incluindo PCR propenso a erros (ep-PCR)2,3, extensão circular da polimerase4 e mutagênese de inserção Mu-transposon 5,6,7. Os dois últimos métodos produzem bibliotecas com diversidade limitada de sequências e são propensos à introdução de grandes inserções e deleções, que são altamente letais para vírus e limitam severamente a recuperação de variantes virais infecciosas.
A EP-PCR é uma conhecida e poderosa técnica de mutagênese amplamente utilizada na engenharia de proteínas para gerar enzimas mutantes para a seleção de fenótipos com propriedades desejadas, tais como maior estabilidade térmica, especificidade do substrato e atividade catalítica 8,9,10. Esta técnica é de fácil execução, pois requer equipamentos simples, não envolve manipulações tediosas, utiliza reagentes disponíveis comercialmente e é rápida; Além disso, gera bibliotecas de alta qualidade.
Aqui, desenvolvemos um novo método para síntese completa de RNA mutante (FL-MRS) para gerar genomas completos do vírus da hepatite C (HCV) através da integração de ep-PCR, que induz mutagênese de substituição aleatória do genoma e genética reversa. Mesmo uma inserção ou deleção de nucleotídeo único é altamente deletéria para vírus de RNA de sentido positivo ([+]ssRNA); portanto, a mutagênese de substituição baseada em PCR é o método preferido para a geração iterativa de grandes e diversas bibliotecas de genomas completos de RNA (+)ss com boa viabilidade.
FL-MRS é uma abordagem direta que pode ser aplicada a qualquer vírus de RNA de sentido positivo com um comprimento de genoma de ~10 kb através do design meticuloso de um conjunto de primers que se liga ao clone de cDNA viral. pJFH1 é um clone de cDNA infeccioso que codifica o genótipo 2a do HCV e pode recapitular todas as etapas do ciclo de vida do vírus. Usando a abordagem da FL-MRS, demonstramos a síntese de bibliotecas do genoma completo mutagenizadas aleatoriamente (bibliotecas mutantes [MLs]) para produzir variantes JFH1 competentes em replicação para as quais não havia conhecimento prévio das propriedades associadas às mutações. Após a exposição a um antiviral, algumas das variantes virais rapidamente superaram a pressão medicamentosa com a mudança fenotípica desejada. Usando o protocolo descrito aqui, uma infinidade de variantes virais pode ser gerada, criando oportunidades para estudar a evolução dos vírus (+)ssRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, detalhamos um procedimento simples e rápido de FL-MRS que integra ep-PCR18 e genética reversa para sintetizar bibliotecas do genoma completo do HCV, que pode então ser usado em um sistema de cultura celular para gerar variantes competentes em replicação para a triagem de fenótipos resistentes a drogas. O uso de Taq DNA polimerase de baixa fidelidade é um pré-requisito da ep-PCR que permite a incorporação de substituições durante a amplificação por PCR de um genoma viral…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio financeiro (número de processo BT/PR10906/MED/29/860/2014) para este estudo foi fornecido pelo Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -. J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
