ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

フォワード遺伝子スクリーニングは、目的のウイルス表現型から始まり、そのゲノム配列を決定し、元の株と比較することで、その表現型の原因となる変異を特定しようとします。対照的に、逆遺伝子スクリーニングでは、標的遺伝子にランダムな変異を導入し、その後、結果として生じる表現型を調べます¹。リバースジェネティクスアプローチでは、in vitro突然変異誘発は、その後、関心のある表現型についてスクリーニングされるバリアントのプールを作成するために最も広く使用されている手法です。RNAウイルスのゲノムワイドなランダム突然変異誘発を実現するために、エラーを起こしやすいPCR(ep-PCR)^2,3、環状ポリメラーゼ伸長⁴、ミュートランスポゾン挿入突然変異誘発5,6,7など、さまざまな遺伝的ツールが報告されています。後者の2つの方法では、配列の多様性が限られており、大きな挿入や欠失が発生しやすく、ウイルスにとって致死性が高く、感染性ウイルス変異体の回復を著しく制限します。

ep-PCRは、熱安定性、基質特異性、^{触媒活性の向上}など、所望の特性を持つ表現型を選択するための変異酵素を生成するために、タンパク質工学で広く使用されている有名な強力な突然変異誘発技術です8,9,10。この手法は、簡単な機器を必要とし、面倒な操作を必要とせず、市販の試薬を使用し、迅速であるため、実行が簡単です。さらに、高品質のライブラリを生成します。

本研究では、ゲノムワイドなランダム置換突然変異誘発とリバースジェネティクスを誘導するep-PCRを組み込んで、C型肝炎ウイルス(HCV)の全ゲノムを作製する完全長変異RNA合成法(FL-MRS)を開発しました。単一のヌクレオチドの挿入または欠失でさえ、ポジティブセンスRNAウイルス([+]ssRNA)にとって非常に有害です。したがって、PCRベースの置換突然変異誘発は、生存率の良いフル(+)ssRNAウイルスゲノムの大規模で多様なライブラリを繰り返し生成するための好ましい方法です。

FL-MRSは、ウイルスcDNAクローンに結合するプライマーセットの細心の注意を払った設計により、ゲノム長が~10 kbのポジティブセンスRNAウイルスに適用できる簡単なアプローチです。pJFH1は、HCV遺伝子型2aをコードする感染性cDNAクローンであり、ウイルスライフサイクルのすべてのステップを再現することができます。FL-MRSアプローチを用いて、ランダムに変異原化された全ゲノムライブラリー(変異体ライブラリー[ML])を合成し、変異に関連する特性に関する予備知識がなかった複製能力のあるJFH1変異体を作製することを実証しました。抗ウイルス薬に曝露すると、一部のウイルス変異体は、望ましい表現型の変化により、薬剤圧力を迅速に克服しました。ここで説明するプロトコルを使用すると、多数のウイルス変異体を生成することができ、(+)ssRNAウイルスの進化を研究する機会が生まれます。