La génétique inverse pour concevoir des variants du virus à ARN à sens positif

Le criblage génétique direct commence par un phénotype viral d’intérêt, puis, en séquençant son génome et en le comparant à celui de la souche d’origine, tente d’identifier la ou les mutations à l’origine de ce phénotype. En revanche, dans les criblages génétiques inversés, des mutations aléatoires sont introduites dans un gène cible, suivies d’un examen du ou des phénotypes résultants1^. Pour l’approche de la génétique inverse, la mutagénèse in vitro est la technique la plus largement utilisée pour créer un pool de variants qui sont ensuite criblés pour les phénotypes d’intérêt. Divers outils génétiques ont été rapportés pour réaliser la mutagénèse aléatoire à l’échelle du génome des virus à ARN, y compris la PCR sujette aux erreurs (ep-PCR)^2,3, l’extension circulaire de la polymérase⁴ et la mutagénèse par insertion de mu-transposons 5,6,7. Ces deux dernières méthodes permettent d’obtenir des bibliothèques abritant une diversité de séquences limitée et sont sujettes à l’introduction d’insertions et de délétions importantes, qui sont hautement létales pour les virus et limitent considérablement la récupération des variants viraux infectieux.

L’ep-PCR est une technique de mutagenèse puissante bien connue largement utilisée dans l’ingénierie des protéines pour générer des enzymes mutantes pour la sélection de phénotypes ayant les propriétés souhaitées, telles qu’une stabilité thermique améliorée, une spécificité du substrat et une activité catalytique 8,9,10. Cette technique est facile à réaliser car elle nécessite un équipement simple, n’implique pas de manipulations fastidieuses, utilise des réactifs disponibles dans le commerce et est rapide ; De plus, il génère des bibliothèques de haute qualité.

Ici, nous avons développé une nouvelle méthode de synthèse d’ARN mutant pleine longueur (FL-MRS) pour générer des génomes complets du virus de l’hépatite C (VHC) en intégrant l’ep-PCR, qui induit une mutagenèse de substitution aléatoire à l’échelle du génome et une génétique inverse. Même l’insertion ou la délétion d’un seul nucléotide est très délétère pour les virus à ARN à sens positif ([+]ssRNA) ; par conséquent, la mutagenèse de substitution basée sur la PCR est la méthode préférée pour la génération itérative de grandes banques diversifiées de génomes complets de virus à ARN (+)ss avec une bonne viabilité.

FL-MRS est une approche simple qui peut être appliquée à n’importe quel virus à ARN de sens positif avec une longueur de génome de ~10 kb grâce à la conception méticuleuse d’un ensemble d’amorces qui se lie au clone d’ADNc viral. pJFH1 est un clone d’ADNc infectieux qui code pour le génotype 2a du VHC et peut récapituler toutes les étapes du cycle de vie du virus. En utilisant l’approche FL-MRS, nous avons démontré la synthèse de banques de génomes complets mutagènes aléatoirement (banques de mutants [MLs]) pour produire des variants de JFH1 compétents pour la réplication pour lesquels il n’y avait aucune connaissance préalable des propriétés associées aux mutations. Lors de l’exposition à un antiviral, certaines des variantes virales ont rapidement surmonté la pression du médicament avec le changement phénotypique souhaité. En utilisant le protocole décrit ici, une pléthore de variants viraux peuvent être générés, créant des opportunités pour étudier l’évolution des virus à (+)ARNss.