Genetica inversa per ingegnerizzare varianti virali a RNA a senso positivo

Lo screening genetico in avanti inizia con un fenotipo virale di interesse e poi, attraverso il sequenziamento del suo genoma e il confronto con quello del ceppo originale, tenta di identificare la mutazione o le mutazioni che causano quel fenotipo. Al contrario, negli screening genetici inversi, vengono introdotte mutazioni casuali in un gene bersaglio, seguite da un esame del fenotipo o dei fenotipi ^risultanti1. Per l’approccio di genetica inversa, la mutagenesi in vitro è la tecnica più utilizzata per creare un pool di varianti che vengono successivamente sottoposte a screening per i fenotipi di interesse. Sono stati descritti vari strumenti genetici per ottenere la mutagenesi casuale a livello di genoma dei virus a RNA, tra cui la PCR soggetta a errore (ep-PCR)^2,3, l’estensione circolare della polimerasi⁴ e la mutagenesi da inserzione di Mu-trasposone 5,6,7. Gli ultimi due metodi producono librerie che ospitano una limitata diversità di sequenza e sono inclini all’introduzione di grandi inserzioni e delezioni, che sono altamente letali per i virus e limitano gravemente il recupero delle varianti virali infettive.

ep-PCR è una potente tecnica di mutagenesi ben nota ampiamente utilizzata nell’ingegneria proteica per generare enzimi mutanti per la selezione di fenotipi con proprietà desiderate, come una maggiore stabilità termica, specificità del substrato e attività catalitica 8,9,10. Questa tecnica è facile da eseguire perché richiede un’attrezzatura semplice, non comporta noiose manipolazioni, utilizza reagenti disponibili in commercio ed è veloce; Inoltre, genera librerie di alta qualità.

Qui, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la sintesi di RNA mutante a lunghezza intera (FL-MRS) per generare genomi completi del virus dell’epatite C (HCV) integrando ep-PCR, che induce mutagenesi di sostituzione casuale a livello di genoma e genetica inversa. Anche l’inserzione o la delezione di un singolo nucleotide è altamente deleteria per i virus a RNA a senso positivo ([+]ssRNA); quindi, la mutagenesi di sostituzione basata sulla PCR è il metodo preferito per la generazione iterativa di librerie ampie e diversificate di genomi di virus a RNA completi (+)ss con buona vitalità.

FL-MRS è un approccio semplice che può essere applicato a qualsiasi virus a RNA a senso positivo con una lunghezza del genoma di ~10 kb attraverso la progettazione meticolosa di un set di primer che si lega al clone di cDNA virale. pJFH1 è un clone di cDNA infettivo che codifica per il genotipo 2a dell’HCV e può ricapitolare tutte le fasi del ciclo di vita del virus. Utilizzando l’approccio FL-MRS, abbiamo dimostrato la sintesi di librerie di genoma completo mutagenizzate in modo casuale (librerie mutanti [ML]) per produrre varianti di JFH1 competenti per la replicazione per le quali non vi era alcuna conoscenza preliminare delle proprietà associate alle mutazioni. Dopo l’esposizione a un antivirale, alcune delle varianti virali hanno rapidamente superato la pressione del farmaco con il cambiamento fenotipico desiderato. Utilizzando il protocollo qui descritto, è possibile generare una pletora di varianti virali, creando opportunità per studiare l’evoluzione dei virus (+)ssRNA.