C. elegans Picks, Spatula ve Neşterleri Sterilize Etmek için Alevsiz Bir Yöntem
Summary
Bu makalede, solucan toplamaları, spatulaları ve neşterleri açık alev yerine bir mikro yakma fırını kullanarak sterilize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans), öncelikle lisans kurumlarında araştırma ve eğitim için en uygun model organizmadır. Lisans öğrencileri, C. elegans kültürlerini korumak için gereken steril tekniği hızlı bir şekilde öğrenebilirler. Solucanları bir plakadan diğerine aktarmak için kullanılan platin toplarının sterilizasyonu, geleneksel olarak bir Bunsen brülöründen veya etanol fenerinden bir alev içinde tutularak yapılır. Bununla birlikte, Bunsen brülörleri bir gaz kaynağına ihtiyaç duyar ve her iki ekipman parçası da açık alevle ilişkili kazara yangın riski taşır. Burada gösterilen, solucan toplamalarını, spatulaları ve neşterleri kızılötesi bakteriyolojik döngü mikro yakma fırını kullanarak sterilize etmek için bir tekniktir. Bu ekipman sadece bir elektrik prizi gerektirir ve potansiyel yangın tehlikelerini en aza indirir. Risk ve gaz gereksinimlerini azaltarak, bu teknik lisans ortamında araştırma ve öğretim için çok uygundur.
Introduction
Model organizma C. elegans, düşük maliyet, bakım kolaylığıve uygulama yelpazesi 1,2,3,4 nedeniyle öncelikle lisans kurumlarında (PUI’ler) hem araştırma hem de eğitim için çok uygundur. Solucanları işlemek için – örneğin, bir solucanı bir plakadan diğerine taşımak için, deneyciler bir solucan toplama kullanabilirler. C. elegans ile kullanılmak üzere çeşitli seçimler yapılabilir veya satın alınabilir. Seçimler en yaygın olarak cam, metal veya ahşap sapa monte edilmiş bir platin veya platin / iridyum ucu kullanılarak yapılır. Cam tutamaklar, tel sabitlenene kadar bir platin telin etrafında bir Pasteur pipeti eriterek şirket içinde yapılabilir. Solucanların ve besin kaynaklarının nasıl yetiştirileceği ve korunacağı da dahil olmak üzere C. elegans yetiştiriciliği hakkında ek bilgiler WormBook5 ve diğer kaynaklardabulunabilir 6,7,8.
C. elegans ile çalışırken, mikroplar ve mantarlarla kontaminasyonu önlemek için tipik olarak aseptik teknikler kullanılır. Aseptik tekniklere örnek olarak aletlerin sterilizasyonu, reaktiflerin otoklavlanması ve steril alanlarda çalışma yapılması verilebilir. Solucan sapları tipik olarak açık alev9 kullanılarak sterilize edilir. Ek olarak, solucan toplamanın sterilizasyonu solucanları yakar, böylece birden fazla solucan suşu ile çalışırken suşların kazara karışmasını önler. Solucan kepçelerini sterilize etmek için tipik yöntemler, bir Bunsen brülöründen, etanol fenerinden veya standart çakmaktan açık bir alev içerir (Tablo 1). Bir lisans öğrencisi bir etanol fenerini doldururken bilmeden etanol döktüğünde ve feneri tutuştururken yanlışlıkla küçük bir yangın başlattığında, laboratuvardaki mevcut yöntemlere daha güvenli alternatifler aramak için motive olduk. Ne yazık ki, etanol fenerleri10,11,12 kullanılarak birçok kaza bildirilmiştir. Neyse ki, mikrobiyolojide kullanılmak üzere alternatif sterilizasyon yöntemleri doğrulanmıştır ve bu makalenin amacı, C. elegans ile kullanılmak üzere aletleri sterilize etmek için bu ekipmanın nasıl kullanılacağını göstermektir.
Mikrobiyoloji laboratuvarlarında aseptik teknik de kritik öneme sahiptir. Platinden yapılmış serolojik halkalar ve teller, açık alev13 veya mikro yakma fırını 14,15,16 kullanılarak sterilize edilir. Mikro yakma fırınlarının diğer isimleri arasında mikro sterilizatörler veya bacto-yakma fırınları bulunur. Mikro yakma fırınının geleneksel alev yöntemlerine göre avantajları arasında yangın tehlikesinin azaltılması, yanan malzemelerin sıçramasının ortadan kaldırılması ve laminer bir akış davlumbazı/biyogüvenlik kabininde çalışabilme yeteneği bulunmaktadır16,17,18. Aslında, hem Amerikan Mikrobiyoloji Derneği hem de Dünya Sağlık Örgütü, açık alev kullanımı üzerinde mikro yakma fırınlarının kullanılmasını önermektedir17,19,20. Bunsen brülörleriyle karşılaştırıldığında, mikro yakma fırınları, bazı laboratuvarların sahip olamayacağı veya öğrencilerin kullanması için her tezgahta bulunmamış olabileceği bir gaz hattı gerektirmez. Bu avantajlardan esinlenerek, C. elegans laboratuvarında toplama, spatula ve neşter gibi yaygın olarak kullanılan aletlerin sterilizasyonu için alev kullanımını mikro yakma fırınlarıyla değiştirmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu yöntem, C. elegans ile çalışırken güvenliği ve / veya esnekliği artırmak isteyen eğitmenler ve araştırmacılar için uygun olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans , lisans öğretim laboratuvarlarındaki alıştırmalar için çok uygun bir model organizmadır. Açık alevler yerine mikro yakma fırınlarının kullanılması hem araştırma laboratuvarlarında hem de sınıf laboratuvarlarında fayda sağlamaktadır. Aslında, lisans laboratuvar dersleri, odadaki yeni eğitilmiş bilim adamlarının sayısı göz önüne alındığında, kazara yangın riski daha yüksek olabilir. Ek olarak, etanol buharları tutuşabilir olduğu için alev kaynağının yakınındaki aletleri sterilize etmek için etanol kullanıldığında yangın riski artar. Taşınabilirlik, her bir tezgahta gaz hatlarının kurulmadığı sınıflar için de bir avantaj sağlar. Bu yöntem, kurumumuzdaki öğretim ve araştırma laboratuvarlarında kullanılmakta olup, 2016 yılında kuruluşundan bu yana kontaminasyonda herhangi bir artış ve sıfır laboratuvar güvenlik kazası ile sonuçlanmıştır.
Mikro yakma fırınlarıyla uyumluluğu sağlamak için, farklı montajlara, tel bileşimlerine ve tel göstergelerine sahip bir dizi seçim test edildi. Tel bileşimi, 30-32 G tel kalınlığına sahip% 100 platin ve% 90 platin / % 10 iridyum içeriyordu ve kalınlık ve bileşimden bağımsız olarak, ısıtma yöntemi tel bütünlüğünden ödün vermedi. Montajlar, ticari olarak temin edilebilen iki farklı tipte toplama kolu ve Pasteur pipetlerden şirket içi cam montajları içeriyordu. Seçimlerin alevde olduğu gibi kırmızı-sıcak yanmadığını unutmayın. Bununla birlikte, sterilizatör uygun sıcaklığa ulaştığı sürece yeterli sterilizasyon hala elde edilir. Bu nedenle, mikro yakma fırınının üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi 10 veya 20 dakika ısınmasına izin vermek çok önemlidir. Sterilizasyonu sağlamak için cihazı odada en az 5 s tutmak da kritik öneme sahiptir. Aletin haznede 7 sn’den daha uzun süre bırakılması cihaza zarar vermez, ancak gereksizdir. Bu, minimum adımlarla nispeten basit bir prosedür olsa da ve sorun giderme gerektirmeyecek olsa da, cihazı yanlara dokunmadan namluda sabitlemeyi öğrenmek biraz pratik gerektirebilir.
Açık bir alevin yerini almak için, bir sterilizasyon yönteminin laboratuvarda kullanılan tüm uygulamaları kapsaması gerekir. C. elegans laboratuvarları, sterilizasyon aletlerine ek olarak, plakaların dökülmesi veya kültürlerin aşılanması gibi diğer görevleri yerine getirmek için steril bir alan oluşturmak için Bunsen brülörlerini de kullanabilir13. Bununla birlikte, bunun steril bir alan yaratıp yaratmadığı veya hala uygulanabilir kirleticileri içerip çekmediği tartışmalı olmaya devam etmektedir14. Tüm kurumlarda bir seçenek olmasa da, bu amaçlar için bir biyogüvenlik kabini veya laminer akış başlığı kullanılabilir ve bir laboratuvarın açık alev kullanmadan çalışmasına izin verir. Çoğu mikro yakma fırını için kullanım kılavuzları, neşter bıçaklarının sterilizasyonunda kullanılmamasını önerir, çünkü iç duvarların kazınması sterilizatöre zarar verir. Bununla birlikte, dikkatli bir şekilde bir kılavuz kullanılırsa, iç duvarlara dokunmadan bir neşter bıçağı veya spatula sterilize edilebilir. Bu, bir alev kullanmadan parçalamaya izin vermek için tekniğin kullanımını genişletir ve bir C. elegans laboratuvarının farklı nesneleri sterilize etmek arasında teknikler değiştirmeden çalışmasına izin verir.
Tablo 1’de belirtildiği gibi, mikro yakma fırınları daha fazla güvenlik, laminer akış davlumbazlarıyla daha fazla uyumluluk ve alev bazlı yöntemlere göre daha fazla taşınabilirlik sunar, ancak sınırlamaları vardır. Diğer yöntemlere göre daha maliyetlidirler ve sterilizasyon sıcaklıklarına ulaşılmadan önce ısınma süresi gerektirirler. Sonuç olarak, birçok mikrobiyoloji laboratuvarında rutin olarak kullanılan bu yöntem, steriliteden ödün vermeden laboratuvar güvenliğini artırmak isteyen bazı C. elegans araştırma ve öğretim laboratuvarlarında uygulanabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Suzanne Howard ve Justin Finne’ye teşekkür eder. Bu çalışma Wellesley College Sinirbilim Bölümü tarafından finanse edildi. N2 solucanları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Bu makalenin yayın ücretleri Wellesley College Kütüphane ve Teknoloji Hizmetleri Açık Erişim Fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
- Attix, H., et al. Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience. microPublication Biology. 2021, (2021).
- Rose, J. K. Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).
- Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- JoVE. Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace. JoVE Science Education Database. , (2022).
- Hope, I. A. . C. elegans: A Practical Approach. , (1999).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Waechter-Brulla, D. Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation. American Society for Microbiology. , (2000).
- Young, J. A. It says in the books that ethanol burns with a cool flame. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488 (2000).
- Mojtabai, F., Kaufman, J. A. . Learning by accident. V. 2. , (2005).
- JoVE. General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner. JoVE Science Education Database. , (2022).
- Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic Technique. Current Protocols in Microbiology. 56 (1), 98 (2020).
- Katz, D. S. The streak plate protocol. American Society for Microbiology Laboratory Protocols. , (2008).
- Public Health Agency of Canada. Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook. Government of Canada. , (2016).
- Emmert, E. A. B. ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale. Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).
- Collins, C. H., Pal, S. B. Health Hazards in Microbiology. Handbook of Laboratory Health and Safety Measures. , (1990).
- Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311 (2020)
- Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. American Society for Microbiology. , (1995).
- Gordon, R. C., Davenport, C. V. Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator. Applied Microbiology. 26 (3), 423 (1973).
- Cold Spring Harbor. LB (Luria-Bertani) liquid medium. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Cold Spring Harbor. Media containing agar or agarose. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
