Um método sem chamas para esterilizar C. elegans Picks, Espástulas e Bisturis
Summary
Este artigo descreve um método para esterilizar picaretas, espátulas e bisturis usando um micro-incinerador no lugar de uma chama aberta.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) é um organismo modelo ideal para pesquisa e educação em instituições de graduação. Os graduandos podem aprender rapidamente a técnica estéril necessária para manter as culturas C. elegans . A esterilização de picaretas de platina usadas para transferir vermes de uma placa para outra é tradicionalmente feita segurando a picareta em uma chama de um queimador de Bunsen ou lanterna de etanol. No entanto, os queimadores de Bunsen requerem uma fonte de gás, e ambos os equipamentos representam o risco de incêndio acidental associado a uma chama aberta. Demonstrado aqui é uma técnica para esterilizar picaretas de vermes, espátulas e bisturis usando um micro-incinerador de loop bacteriológico infravermelho. Este equipamento requer apenas uma tomada elétrica e minimiza possíveis riscos de incêndio. Ao reduzir os riscos e os requisitos de gás, essa técnica é adequada para pesquisa e ensino em um ambiente de graduação.
Introduction
O organismo modelo C. elegans é adequado tanto para pesquisa quanto para a educação em instituições de graduação (PUIs) devido ao baixo custo, facilidade de manutenção e gama de aplicações 1,2,3,4. A fim de lidar com vermes – por exemplo, para mover um verme de uma placa para outra, os experimentadores podem usar uma picareta de vermes. Uma variedade de picaretas podem ser feitas ou compradas para uso com C. elegans. As picaretas são mais comumente feitas usando uma ponta de platina ou platina/irídio, montada em um copo, metal ou alça de madeira. As alças de vidro podem ser feitas internamente derretendo uma pipeta Pasteur em torno de um fio de platina até que o fio esteja seguro. Informações adicionais sobre a criação de C. elegans, incluindo como cultivar e manter vermes e suas fontes de alimento, podem ser encontradas no WormBook5 e outras fontes 6,7,8.
Ao trabalhar com C. elegans, técnicas assépticas são tipicamente usadas para evitar contaminação com micróbios e fungos. Exemplos de técnicas assépticas incluem esterilização de instrumentos, autoclavagem de reagentes e condução de trabalhos em campos estéreis. As picaretas de vermes são tipicamente esterilizadas usando uma chama aberta9. Além disso, a esterilização da picareta de vermes incinera vermes, evitando assim misturas acidentais de cepas ao trabalhar com múltiplas cepas de vermes. Os métodos típicos para esterilizar picaretas de vermes envolvem uma chama aberta de um queimador de Bunsen, lanterna de etanol ou isqueiro padrão (Tabela 1). Fomos motivados a buscar alternativas mais seguras aos métodos existentes em laboratório quando um estudante de graduação, sem saber, derramou etanol enquanto enchia uma lanterna de etanol e acidentalmente iniciou um pequeno incêndio ao acender a lanterna. Infelizmente, muitos acidentes foram relatados usando lanternas de etanol 10,11,12. Felizmente, métodos alternativos de esterilização foram validados para uso em microbiologia, e o objetivo deste artigo é demonstrar como utilizar este equipamento para esterilizar instrumentos para uso com C. elegans.
Nos laboratórios de microbiologia, a técnica asséptica também é crítica. Laços sorológicos e fios feitos de platina são esterilizados usando uma chama aberta13 ou um micro-incinerador 14,15,16. Outros nomes para micro-incineradores incluem micro-esterilizadores ou bacto-incineradores. As vantagens do micro-incinerador sobre os métodos tradicionais de chama incluem redução do risco de incêndio, eliminação de respingos de materiais incinerados e capacidade de trabalhar em um armário de capô de fluxo laminar/biossegurança 16,17,18. De fato, tanto a Sociedade Americana de Microbiologia quanto a Organização Mundial da Saúde recomendam o uso de micro-incineradores sobre o uso de uma chama abertade 17,19,20. Em comparação com os queimadores de Bunsen, os micro-incineradores também não exigem uma linha de gás, que alguns laboratórios podem não ter, ou podem não ter localizado em cada banco para os alunos usarem. Inspirado nessas vantagens, foi desenvolvido um protocolo para substituir o uso de chama por micro-incineradores para esterilização de instrumentos comumente usados, como picaretas, espátulas e bisturis no laboratório C. elegans. Este método pode ser apropriado para instrutores e pesquisadores que buscam aumentar a segurança e/ou flexibilidade ao trabalhar com C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans é um organismo modelo bem adequado para exercícios em laboratórios de ensino de graduação. O uso de micro-incineradores no lugar de chamas abertas proporciona benefícios tanto em laboratórios de pesquisa quanto em laboratórios de sala de aula. De fato, cursos de laboratório de graduação podem representar um risco maior de incêndios acidentais, dado o número de cientistas recém-treinados na sala. Além disso, o risco de incêndio aumenta quando o etanol é usado para esterilizar instrumentos próximos à fonte de chama, pois vapores de etanol são inflamáveis. A portabilidade também confere uma vantagem para as salas de aula onde as linhas de gás não são instaladas em cada banco. Esse método tem sido empregado em laboratórios de ensino e pesquisa em nossa instituição, resultando em não aumento de contaminação e zero acidentes de segurança laboratorial desde sua incorporação em 2016.
Para garantir a compatibilidade com micro-incineradores, foram testadas uma série de picaretas com diferentes montagens, composições de fios e medidores de arame. A composição do fio incluiu 100% de platina, bem como 90% de platina/10% de irídio com espessura de fio de 30-32 G, e independentemente da espessura e composição, o método de aquecimento não comprometeu a integridade do fio. As montagens incluíram dois tipos diferentes de alças de picaretas disponíveis comercialmente e montagens de vidro feitas em casa de pipetas Pasteur. Note que as picaretas não brilham em vermelho-quente como fazem na chama. No entanto, a esterilização suficiente ainda é alcançada desde que o esterilizador tenha atingido a temperatura adequada. Assim, é fundamental permitir que o microcinerador aqueça por 10 ou 20 min, conforme indicado nas instruções do fabricante. Manter o instrumento na câmara por pelo menos 5 s para alcançar a esterilização também é fundamental. Deixar o instrumento na câmara com mais de 7 s não causará danos ao instrumento, mas é desnecessário. Embora este seja um procedimento relativamente simples com passos mínimos e é improvável que precise de solução de problemas, pode ser preciso alguma prática para aprender a estabilizar o instrumento no barril sem tocar nas laterais.
Para substituir uma chama aberta, um método de esterilização deve cobrir todas as aplicações utilizadas em laboratório. Além de esterilizar instrumentos, os laboratórios C. elegans também podem usar queimadores bunsen para criar um campo estéril para fazer outras tarefas, como derramar placas ou vacinar culturas13. No entanto, se isso cria um campo estéril ou atrai contaminantes ainda viáveis permanece controverso14. Embora não seja uma opção em todas as instituições, um armário de biossegurança ou capô de fluxo laminar pode ser usado para esses fins, permitindo que um laboratório funcione sem o uso de chamas abertas. Manuais de instrução para a maioria dos micro-incineradores recomendam o uso para esterilização de lâminas de bisturi porque a raspagem das paredes internas danifica o esterilizador. No entanto, se usar cuidadosamente um guia, pode-se esterilizar uma lâmina de bisturi ou espátula sem tocar nas paredes internas. Isso amplia o uso da técnica para permitir a escoamento sem o uso de uma chama e permite que um laboratório C. elegans funcione sem alternar técnicas entre esterilizar diferentes objetos.
Conforme descrito na Tabela 1, os micro-incineradores oferecem maior segurança, maior compatibilidade com capô de fluxo laminar e maior portabilidade sobre métodos baseados em chama, mas têm limitações. Eles são mais caros do que os outros métodos e requerem um tempo de aquecimento antes que as temperaturas de esterilização sejam alcançadas. Em conclusão, este método que é rotineiramente utilizado em muitos laboratórios de microbiologia, pode ser aplicável em alguns laboratórios de pesquisa e ensino de C. elegans que buscam melhorar a segurança laboratorial sem comprometer a esterilidade.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer Suzanne Howard e Justin Finne. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Neurociências da Faculdade wellesley. Os worms N2 foram fornecidos pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). As taxas de publicação deste artigo foram apoiadas pelo Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
Materials
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
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