Eine flammenfreie Methode zur Sterilisation von C. elegans Picks, Spateln und Skalpellen
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zum Sterilisieren von Wurmpickeln, Spateln und Skalpellen mit einer Mikroverbrennungsanlage anstelle einer offenen Flamme.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) ist ein optimaler Modellorganismus für Forschung und Lehre an primär universitären Einrichtungen. Studenten können schnell die sterile Technik erlernen, die erforderlich ist, um C. elegans-Kulturen zu erhalten. Die Sterilisation von Platinpickeln, die zum Übertragen von Würmern von einer Platte auf eine andere verwendet werden, erfolgt traditionell, indem der Meißel in einer Flamme von einem Bunsenbrenner oder einer Ethanollaterne gehalten wird. Bunsen-Brenner benötigen jedoch eine Gasquelle, und beide Geräte bergen das Risiko eines versehentlichen Brandes, der mit einer offenen Flamme verbunden ist. Hier wird eine Technik zur Sterilisation von Wurmpicks, Spateln und Skalpellen mit einer bakteriologischen Infrarot-Schleifenmikroverbrennungsanlage demonstriert. Dieses Gerät benötigt nur eine Steckdose und minimiert potenzielle Brandgefahren. Durch die Senkung des Risiko- und Gasbedarfs eignet sich diese Technik gut für Forschung und Lehre im Grundstudium.
Introduction
Der Modellorganismus C. elegans eignet sich aufgrund der geringen Kosten, der Wartungsfreundlichkeit und des Anwendungsspektrums 1,2,3,4 sowohl für die Forschung als auch für die Lehre an primär grundständigen Einrichtungen (PUIs). Um mit Würmern umzugehen – zum Beispiel, um einen Wurm von einer Platte zur anderen zu bewegen, können Experimentatoren einen Wurmpickel verwenden. Eine Vielzahl von Picks kann für die Verwendung mit C. elegans hergestellt oder gekauft werden. Plektren werden am häufigsten mit einer Platin- oder Platin / Iridium-Spitze hergestellt, die in einem Glas-, Metall- oder Holzgriff montiert ist. Glasgriffe können im eigenen Haus hergestellt werden, indem eine Pasteur-Pipette um einen Platindraht geschmolzen wird, bis der Draht sicher ist. Weitere Informationen über die Haltung von C. elegans, einschließlich des Anbaus und der Pflege von Würmern und ihrer Nahrungsquellen, finden Sie in WormBook5 und anderen Quellen 6,7,8.
Bei der Arbeit mit C. elegans werden aseptische Techniken typischerweise verwendet, um eine Kontamination mit Mikroben und Pilzen zu verhindern. Beispiele für aseptische Techniken sind die Sterilisation von Instrumenten, die Autoklavierung von Reagenzien und die Durchführung von Arbeiten in sterilen Bereichen. Wurmpicks werden typischerweise mit einer offenen Flamme9 sterilisiert. Darüber hinaus verbrannt die Sterilisation des Wurmpickels Würmer und verhindert so versehentliche Verwechslungen von Stämmen bei der Arbeit mit mehreren Wurmstämmen. Typische Methoden zum Sterilisieren von Wurmpicks beinhalten eine offene Flamme entweder von einem Bunsenbrenner, einer Ethanollaterne oder einem Standardfeuerzeug (Tabelle 1). Wir waren motiviert, sicherere Alternativen zu bestehenden Methoden im Labor zu suchen, als ein Student unwissentlich Ethanol verschüttete, während er eine Ethanollaterne füllte, und versehentlich ein kleines Feuer auslöste, als er die Laterne entzündete. Leider wurden viele Unfälle mit Ethanollaternen10,11,12 gemeldet. Glücklicherweise wurden alternative Sterilisationsmethoden für den Einsatz in der Mikrobiologie validiert, und der Zweck dieses Artikels ist es, zu demonstrieren, wie man dieses Gerät verwendet, um Instrumente für die Verwendung mit C. elegans zu sterilisieren.
In mikrobiologischen Labors ist die aseptische Technik ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Serologische Schleifen und Drähte aus Platin werden entweder mit einer offenen Flamme 13 oder einer Mikroverbrennungsanlage14,15,16 sterilisiert. Andere Namen für Mikroverbrennungsanlagen sind Mikrosterilisatoren oder Bacto-Verbrennungsanlagen. Zu den Vorteilen der Mikroverbrennungsanlage gegenüber herkömmlichen Flammenmethoden gehören die Verringerung der Brandgefahr, die Eliminierung des Vergießens von verbrannten Materialien und die Möglichkeit, in einer laminaren Haube / Biosicherheitskabine16,17,18 zu arbeiten. Tatsächlich empfehlen sowohl die American Society of Microbiology als auch die Weltgesundheitsorganisation die Verwendung von Mikroverbrennungsanlagen gegenüber der Verwendung einer offenen Flamme17,19,20. Im Vergleich zu Bunsenbrennern benötigen Mikroverbrennungsanlagen auch keine Gasleitung, die einige Labors möglicherweise nicht haben oder nicht an jeder Bank für Studenten zur Verfügung gestellt haben. Inspiriert von diesen Vorteilen wurde ein Protokoll entwickelt, um die Verwendung von Flammen durch Mikroverbrennungsanlagen zur Sterilisation von häufig verwendeten Instrumenten wie Spitzhacken, Spateln und Skalpellen im Labor von C. elegans zu ersetzen. Diese Methode kann für Ausbilder und Forscher geeignet sein, die die Sicherheit und/oder Flexibilität bei der Arbeit mit C. elegans verbessern möchten.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans ist ein Modellorganismus, der sich gut für Übungen in Bachelor-Lehrlabors eignet. Die Verwendung von Mikroverbrennungsanlagen anstelle von offenen Flammen bietet Vorteile sowohl in Forschungslabors als auch in Klassenzimmerlabors. In der Tat können Bachelor-Laborkurse angesichts der Anzahl der neu ausgebildeten Wissenschaftler im Raum ein höheres Risiko für versehentliche Brände darstellen. Darüber hinaus steigt das Brandrisiko, wenn Ethanol verwendet wird, um Instrumente in der Nähe der Flammenquelle zu sterilisieren, da Ethanoldämpfe entzündbar sind. Die Portabilität bietet auch einen Vorteil für Klassenzimmer, in denen nicht an jedem Prüfstand Gasleitungen installiert sind. Diese Methode wurde in Lehr- und Forschungslabors an unserer Einrichtung eingesetzt, was seit ihrer Gründung im Jahr 2016 zu keiner Zunahme der Kontamination und zu null Laborsicherheitsunfällen geführt hat.
Um die Kompatibilität mit Mikroverbrennungsanlagen sicherzustellen, wurde eine Reihe von Meißeln mit unterschiedlichen Halterungen, Drahtzusammensetzungen und Drahtlehren getestet. Die Drahtzusammensetzung umfasste 100% Platin sowie 90% Platin / 10% Iridium mit einer Drahtdicke von 30-32 G, und unabhängig von Dicke und Zusammensetzung beeinträchtigte die Heizmethode die Drahtintegrität nicht. Die Halterungen umfassten zwei verschiedene Arten von kommerziell erhältlichen Pickgriffen und hauseigene Glashalterungen von Pasteur-Pipetten. Beachten Sie, dass Picks nicht glühend heiß leuchten wie in der Flamme. Eine ausreichende Sterilisation ist jedoch weiterhin erreicht, solange der Sterilisator die richtige Temperatur erreicht hat. Daher ist es wichtig, die Mikroverbrennungsanlage für 10 oder 20 Minuten aufwärmen zu lassen, wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben. Das Gerät mindestens 5 s in der Kammer zu halten, um eine Sterilisation zu erreichen, ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung. Wenn Sie das Instrument länger als 7 s in der Kammer lassen, wird das Instrument nicht beschädigt, ist aber unnötig. Während dies ein relativ einfaches Verfahren mit minimalen Schritten ist und wahrscheinlich keine Fehlerbehebung erfordert, kann es einige Übung erfordern, um zu lernen, das Instrument im Lauf zu stabilisieren, ohne die Seiten zu berühren.
Um eine offene Flamme zu ersetzen, muss eine Sterilisationsmethode alle in einem Labor verwendeten Anwendungen abdecken. Zusätzlich zur Sterilisation von Instrumenten können C. elegans Labore Bunsenbrenner auch verwenden, um ein steriles Feld für andere Aufgaben wie das Gießen von Platten oder das Impfen von Kulturen zu schaffen13. Ob dies jedoch ein steriles Feld schafft oder noch lebensfähige Verunreinigungen anzieht, bleibtumstritten 14. Obwohl dies nicht in allen Einrichtungen eine Option ist, kann eine Biosicherheitswerkbank oder eine Laminar-Flow-Haube für diese Zwecke verwendet werden, so dass ein Labor ohne den Einsatz offener Flammen funktionieren kann. Bedienungsanleitungen für die meisten Mikroverbrennungsanlagen raten von der Verwendung zur Sterilisation von Skalpellklingen ab, da das Abkratzen der Innenwände den Sterilisator beschädigt. Wenn man jedoch vorsichtig eine Führung verwendet, kann man eine Skalpellklinge oder einen Spatel sterilisieren, ohne die Innenwände zu berühren. Dies erweitert die Verwendung der Technik, um das Chunking ohne Verwendung einer Flamme zu ermöglichen, und ermöglicht es einem C. elegans-Labor , zu funktionieren, ohne die Techniken zwischen der Sterilisation verschiedener Objekte zu wechseln.
Wie in Tabelle 1 beschrieben, bieten Mikroverbrennungsanlagen eine erhöhte Sicherheit, eine erhöhte Kompatibilität mit Laminar-Flow-Hauben und eine erhöhte Portabilität gegenüber flammenbasierten Methoden, haben jedoch Einschränkungen. Sie sind teurer als die anderen Methoden und benötigen eine Aufwärmzeit, bevor Sterilisationstemperaturen erreicht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Methode, die routinemäßig in vielen mikrobiologischen Laboratorien verwendet wird, in einigen Forschungs- und Lehrlaboratorien von C. elegans anwendbar sein kann, die die Laborsicherheit verbessern wollen, ohne die Sterilität zu beeinträchtigen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Suzanne Howard und Justin Finne danken. Diese Arbeit wurde vom Wellesley College Neuroscience Department finanziert. N2-Würmer wurden vom CGC bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Die Publikationsgebühren für diesen Artikel wurden vom Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund unterstützt.
Materials
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
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