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Biology

C. elegansピック、ヘラ、メスを滅菌するための無炎法

Published: March 04, 2022
doi:
10.3791/63578
,
1Neuroscience Department,Wellesley College

Summary

この記事では、裸火の代わりにマイクロ焼却炉を使用してワームピック、ヘラ、メスを滅菌する方法について説明します。

Abstract

Caenorhabtidis elegans(C. elegans) は、主に学部機関での研究と教育に最適なモデル生物です。学部生は、 C. elegans 培養を維持するために必要な滅菌技術を迅速に学ぶことができます。あるプレートから別のプレートにワームを移すために使用されるプラチナピックの滅菌は、伝統的にブンゼンバーナーまたはエタノールランタンからの炎の中にピックを保持することによって行われます。しかし、ブンゼンバーナーはガス源を必要とし、両方の機器は裸火に関連する偶発的な火災のリスクをもたらします。ここでは、赤外線細菌学ループマイクロ焼却炉を使用してワームピック、ヘラ、メスを滅菌する技術を紹介します。この装置はコンセントのみを必要とし、潜在的な火災の危険性を最小限に抑えます。リスクとガスの要件を下げることで、この技術は学部環境での研究や教育に適しています。

Introduction

モデル生物C. elegansは、低コスト、メンテナンスの容易さ、およびアプリケーションの範囲1、2、3、4のために、主に学部機関(PUI)での研究と教育の両方に適しています。ワームを処理するために – 例えば、ワームをあるプレートから別のプレートに移動するために、実験者はワームピックを使うことができます。C. elegansで使用するために、さまざまなピックを作成または購入できます。ピックは、ガラス、金属、または木製のハンドルに取り付けられたプラチナまたはプラチナ/イリジウムチップを使用して最も一般的に作られています。ガラスハンドルは、ワイヤーが固定されるまでプラチナワイヤーの周りにパスツールピペットを溶かすことによって社内で作ることができます。ワームとその食料源を成長させ維持する方法を含む、C. elegansの飼育に関する追加情報は、WormBook5および他の情報源6,7,8で見つけることができます。

C. elegansを扱う場合、無菌技術は、典型的には、微生物および真菌による汚染を防止するために使用される。無菌技術の例には、器具の滅菌、試薬のオートクレーブ処理、および滅菌分野での作業の実施が含まれる。ワームピックは、典型的には、直火9を用いて滅菌される。さらに、ワームピックの滅菌はワームを焼却し、複数のワーム株を扱う際の系統の偶発的な混同を防ぎます。ワームピックを滅菌する典型的な方法には、ブンゼンバーナー、エタノールランタン、または標準ライターのいずれかからの直火が含まれます(表1)。研究室の既存の方法に代わるより安全な選択肢を模索しようと思ったのは、学部生がエタノール提灯を充填中に知らず知らずのうちにエタノールをこぼし、ランタンに点火するときに誤って小さな火をつけたときでした。残念なことに、エタノールランタン10、11、12を使用して多くの事故が報告されている。幸いなことに、微生物学での使用については別の滅菌方法が検証されており、この記事の目的は、この装置を使用してC. elegansで使用する器具を滅菌する方法を示すことです。

微生物学の研究室では、無菌技術も重要です。白金からなる血清学的ループおよびワイヤは、直火13またはマイクロ焼却炉14、15、16のいずれかを用いて滅菌される。マイクロ焼却炉の他の名称には、マイクロ滅菌器またはバクト焼却炉が含まれる。従来の火炎法に対するマイクロ焼却炉の利点には、火災の危険性の低減、焼却された材料の飛散の排除、および層流フード/バイオセーフティキャビネット16,17,18で動作する能力が含まれる。実際、米国微生物学会と世界保健機関(WHO)は、直火の使用よりもマイクロ焼却炉の使用を推奨しています17,19,20。ブンゼンバーナーと比較して、マイクロ焼却炉はガスラインも必要とせず、一部の研究室にはガスラインがなく、学生が使用できるように各ベンチに配置されていない可能性があります。これらの利点に触発されて、C. elegans研究所でピック、ヘラ、メスなどの一般的に使用される器具を滅菌するための火炎の使用をマイクロ焼却炉に置き換えるためのプロトコルが開発されました。この方法は、C. elegansと作業する際の安全性および/または柔軟性を高めようとするインストラクターおよび研究者にとって適切であり得る。

Protocol

1. マイクロ焼却炉の準備 ループホルダーアクセサリーガイドを外側のバレルにクリップしてマイクロ焼却炉に取り付けます。 必要に応じて、マイクロ焼却炉を標準の120 Vまたは230 Vのコンセントに差し込みます。注: これは、ベンチトップまたは層流フードで実行できます。 マイクロ焼却炉を高い設定にし、製造元の指示に従って10〜20分間ウォームアップして、800〜825 °Cの最適温度に達します。メモ:焼却炉を3時間以上オンにしておく場合は、より低い温度設定(500 oC)をスタンバイ設定として使用できます。メーカーのユーザーマニュアルによると、これにより機器の使用可能寿命が延びます。 2.ピック、ヘラ、またはメスを殺菌する ガイド21に沿ってスライドさせることにより側面に触れることなく円筒状の殺菌領域に器具を挿入する。メモ:メスを滅菌する場合は、ブレードでセラミックの壁に触れないようにすることが重要です。セラミック壁をこすり取ると、加熱ユニットの完全性が損なわれる可能性があります。 器具を滅菌エリアに5〜7秒間保持します。 ガイドに沿って後方にスライドさせて、側面に触れずに楽器を取り外します。 ピックの場合は、ワームに触れる前に楽器を3〜5秒間冷やして、ワームを燃やさないようにします。注:冷やすことが許されていないメスやヘラは寒天を歌います。 ワームをピッキングした後、ピックをチャンバーに5〜7秒間挿入し直して、ピック上のワームを焼却します。 3. 比較方法 – ブンゼンバーナーを用いた器具の滅菌 ブンゼンバーナーをゴムチューブを使用してガスラインに接続します。チューブをしっかりと固定し、バーナーを頭上の物体から遠ざけてください。 ガスラインのつまみを回してガスを入れます。 ストライカーまたはライターを使用してバーナーに点火します。 青い円錐形が見えるまで、ガスノブと吸気口を使用して炎を調整します。 ピック、ヘラ、またはメスを赤く光るまで炎の中に入れます。 ピックの場合は、ワームに触れる前に楽器を3〜5秒間冷やして、ワームを燃やさないでください。注:冷やすことが許されていないメスやヘラは寒天を歌います。 ワームをピッキングした後、ピックを炎の中に挿入し直して、ピック上のワームを焼却します。 4. 実験 OP50大腸菌(E.coli)細菌をルリアブロス22中で37oCシェーカー上で一晩培養する。 一晩培養した後、培養物を滅菌水で1:100の割合で希釈する。注:この希釈係数は、めっき後のコロニーの分離を確実にするために選択されました。 ブンゼンバーナーで滅菌したワームピックを菌液に浸し、ブンゼンバーナーで再滅菌し、滅菌水100mLで渦巻く。 10 cm LB寒天22,23シャーレに100 μLの水をプレートし、滅菌細胞スプレッダーを使用して水を広げ、蓋をして室温で24時間インキュベートした。 マイクロ焼却炉で滅菌したワームピックを使用して、手順4.3~4.4を実行します。 陽性対照として、再滅菌せずにステップ4.3~4.4を実行する。 陰性対照として、細菌溶液の代わりに滅菌水を用いてステップ4.3〜4.4を行う。 潜伏期間後にコロニーを手動でカウントする。

Representative Results

マイクロ焼却炉と炎の相対的な汚染率を実証するために、簡単な実験(セクション4)が考案されました(図1、 表2)。これらの結果は、方法間の汚染率を表していますが、マイクロ焼却炉技術を使用するためにこの方法を繰り返す必要はありません。実験は3連で行った。陰性対照は、細菌を含まない滅菌水であった。ポジティブコントロールはどちらも滅菌技術を用いなかった:ピックを希釈OP50培養物に浸漬し、次いで滅菌水に直接移した。すべての反復と条件は、同じ日に並列に実行されました。3つの陰性対照プレートすべてにおいて、ゼロコロニーが計数された。ブンゼンバーナーを使用してピックを滅菌すると、平均4.7(±0.3SEM)のコロニーが得られました。マイクロ焼却炉条件では、3.3(±1.2SEM)コロニーの平均カウントが観察された。しかし、陽性対照条件では平均数298.3(±17.9SEM)のコロニーが得られた。ブンゼンバーナーとマイクロ焼却炉を比較する等分散を仮定した2裾 t検定では、統計的に有意な差はなく、 p = 0.35でした。これにより、マイクロ焼却炉はブンゼンバーナーと同等の効果で無菌性の結果を達成した。 図1:滅菌方法全体の細菌数。 ピックを滅菌水中の1:100 OP50培養物に浸漬し、次いでブンゼンバーナーまたはマイクロ焼却炉を用いて滅菌した。次いで、ピックを滅菌水に浸漬し、LB寒天22、23上に播種し、室温で24時間インキュベートし、コロニーを手動で計数した。陽性対照は滅菌を行わず、陰性対照は細菌を含まない滅菌水を使用した。n = 条件ごとに3回の反復。注: Y 軸は、グラフの関連部分でデータ ポイントを分離できるように壊れています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 滅菌方法 費用 ラボの要件 利点 欠点 マイクロ焼却炉 365–530ドル 120 V または 230 V コンセント • ポータブル• 裸火や露出した発熱体なし• 層流フードおよび生物学的安全キャビネットで使用可能 •ウォームアップ時間• より高いコスト ブンゼンバーナー 24–169ドル ガスライン • 高速セットアップ• 低コスト • オープンフレーム• 層流フードや生物学的安全キャビネットでの使用は推奨されません エタノールランプ 11ドル 何一つ • 高速セットアップ• 低コスト• 詰め替え可能 • オープンフレーム• 補充時の安全上の問題• 層流フードや生物学的安全キャビネットでの使用は推奨されません•特定の機関では許可されていません ライター 5–8ドル 何一つ • 低コスト•アクセス可能• 使い捨て• 詰め替え可能 • オープンフレーム• 手動操作• 層流フードや生物学的安全キャビネットでの使用は推奨されません 表1:滅菌器具の方法の比較。 器具を滅菌するための4つの方法は、利点、欠点、コスト、および実験室の要件に基づいて比較された。 レプリケート 条件 マイクロ焼却炉 ブンゼンバーナー ネガティブコントロール ポジット制御 1 1 5 0 278 2 4 4 0 334 3 5 5 0 283 意味する 3.3 4.7 0.0 298.3 SEM 1.2 0.3 0.0 17.9 表2:滅菌方法全体の細菌数の生データ。 ピックを滅菌水中の1:100 OP50培養物に浸漬し、次いでブンゼンバーナーまたはマイクロ焼却炉を用いて滅菌した。次いで、ピックを滅菌水に浸漬し、LB寒天22、23上に播種し、室温で24時間インキュベートし、コロニーを手動で計数した。陽性対照は滅菌を行わず、陰性対照は細菌を含まない滅菌水を使用した。n = 条件ごとに3回の反復。平均およびSEMは、個々のカウントの下に報告されました。

Discussion

C. elegans は、学部の教育研究室での演習に適したモデル生物です。裸火の代わりにマイクロ焼却炉を使用することは、研究室と教室の研究室の両方で利点をもたらします。実際、学部の研究室のコースは、部屋に新しく訓練された科学者の数を考えると、偶発的な火災のリスクが高くなる可能性があります。さらに、エタノール蒸気が着火可能であるため、エタノールを使用して火の発生源の近くで器具を滅菌すると、火災のリスクが高まります。携帯性は、各ベンチにガスラインが設置されていない教室にも利点をもたらします。この方法は、当校の教育・研究所で採用されており、2016年の法人化以来、汚染の増加はなく、実験室の安全事故はゼロです。

マイクロ焼却炉との互換性を確保するために、異なる取り付け、ワイヤ組成、およびワイヤゲージを備えたさまざまなピックがテストされました。ワイヤ組成は、ワイヤ厚さ30〜32Gの白金100%および90%プラチナ/10%イリジウムを含み、厚さおよび組成にかかわらず、加熱方法はワイヤの完全性を損なわなかった。取り付けには、2つの異なるタイプの市販のピックハンドルとパスツールピペットの自社製ガラス取り付けが含まれていました。ピックは炎の中のように赤熱しないことに注意してください。しかし、滅菌器が適切な温度に達している限り、十分な滅菌が依然として達成される。したがって、製造元の説明書に示されているように、マイクロ焼却炉を10分または20分間ウォームアップさせることが重要です。滅菌を達成するために、機器を少なくとも5秒間チャンバー内に保持することも重要です。7秒より長くチャンバー内に楽器を置いても、楽器に害を及ぼすことはありませんが、不要です。これは最小限の手順で比較的簡単な手順であり、トラブルシューティングが必要になる可能性は低いですが、側面に触れることなく計測器をバレル内に固定する方法を学ぶには、ある程度の練習が必要になる場合があります。

裸火を置き換えるためには、滅菌方法は実験室で使用されるすべての用途をカバーしなければなりません。滅菌器具に加えて、 C. elegans研究所 は、Bunsenバーナーを使用して、プレートを注ぐか、培養物を接種するなどの他の作業を行うための滅菌フィールドを作成することもできます13。しかし、これが無菌のフィールドを作り出すのか、それともまだ生存可能な汚染物質を吸い込むのかは、依然として議論の余地があります14。すべての施設でオプションではありませんが、バイオセーフティキャビネットまたは層流フードをこれらの目的に使用でき、裸火を使用せずに実験室を機能させることができます。ほとんどのマイクロ焼却炉の取扱説明書では、内壁を削ると滅菌器が損傷するため、メスの刃の滅菌に使用することを推奨しています。しかし、慎重にガイドを使用すると、内壁に触れることなくメスの刃やヘラを滅菌することができます。これにより、この技術の使用が拡張され、炎を使用せずにチャンク化が可能になり、 C. elegansラボが 異なる物体を滅菌する技術を切り替えることなく機能できるようになります。

表1に概説されているように、マイクロ焼却炉は安全性の向上、層流フードとの互換性の向上、および火炎ベースの方法に対する携帯性の向上を提供しますが、制限があります。それらは他の方法よりも高価であり、滅菌温度が達成される前にウォームアップ時間を必要とする。結論として、多くの微生物学研究室で日常的に使用されているこの方法は、無菌性を損なうことなく実験室の安全性を向上させようとするいくつかのC. elegans研究および教育研究室に適用できるかもしれない。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、スザンヌ・ハワードとジャスティン・フィンに感謝したい。この研究はウェルズリー大学神経科学部から資金提供を受けた。N2ワームは、NIH研究インフラプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されているCGCによって提供されました。この記事の出版料は、Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fundの支援を受けた。

Materials

90% platinum 10% iridium wire Tritech PT-9010 Other sources and wire compositions may be used.
Agarose Sigma Aldrich A6013 LB agar ingredient
Bunsen burner Fisher Scientific 50-110-1225 Other Bunsen burners may be used
Ethanol Lamp Carolina 706604 Included here as a reference to Table 1
Lighter Carolina 706636 Included here as a reference to Table 1
Loop holder accessory Fisher 22-630-002 Referred to in the manuscript as "guide"
Micro-incinerator Thomas Scientific 1154J15 There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001),  Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702).
N2 worms CGC N2
NaCl Sigma Aldrich S5886 LB ingredient
OP50 E. coli CGC OP50
Petri dish Fisher 08-772B
Pick handle Tritech TWPH1
Scalpel blade Fisher 12-000-161
Scalpel handle Fisher 12-000-164
Spatula Fisher 14-374 Other spatulas will work
Sterile cell spreaders VWR 76206-438 Other cell spreaders may be used as long as they are sterile
Tryptone Sigma Aldrich T7293 LB ingredient
Yeast Extract Sigma Aldrich Y1625 LB ingredient
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References

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Flame-free SterilizationC. ElegansPicksSpatulasScalpelsMicro-incineratorBunsen BurnerAseptic TechniqueOP50 E. ColiBacterial Solution

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Stifter, H., Bauer, D. E. A Flame-Free Method for Sterilizing C. elegans Picks, Spatulas, and Scalpels. J. Vis. Exp. (181), e63578, doi:10.3791/63578 (2022).
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