طريقة خالية من اللهب لتعقيم مختارات C. elegans والبقع والمشارط
Summary
توضح هذه المقالة طريقة لتعقيم مخالب الدودة والملاعق والمشارط باستخدام محرقة صغيرة بدلا من اللهب المفتوح.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) هو كائن حي نموذجي مثالي للبحث والتعليم في المؤسسات الجامعية في المقام الأول. يمكن للطلاب الجامعيين تعلم التقنية المعقمة المطلوبة للحفاظ على ثقافات C. elegans . بسرعة. يتم تعقيم اللقطات البلاتينية المستخدمة لنقل الديدان من طبق إلى آخر تقليديا عن طريق حمل اللقطة في لهب من موقد بنسن أو فانوس الإيثانول. ومع ذلك ، تتطلب شعلات بنسن مصدرا للغاز ، وتشكل كلتا القطعتين من المعدات خطر نشوب حريق عرضي مرتبط بلهب مفتوح. يظهر هنا تقنية لتعقيم مخاليق الدودة والملاعق والمشارط باستخدام محرقة دقيقة للحلقة البكتريولوجية بالأشعة تحت الحمراء. لا يتطلب هذا الجهاز سوى مأخذ كهربائي ويقلل من مخاطر الحريق المحتملة. من خلال خفض متطلبات المخاطر والغاز ، فإن هذه التقنية مناسبة تماما للبحث والتدريس في بيئة جامعية.
Introduction
الكائن الحي النموذجي C. elegans مناسب تماما لكل من البحث والتعليم في المؤسسات الجامعية في المقام الأول (PUIs) بسبب التكلفة المنخفضة وسهولة الصيانة ومجموعة التطبيقات1،2،3،4. من أجل التعامل مع الديدان – على سبيل المثال ، لنقل دودة من لوحة إلى أخرى ، يمكن للمجربين استخدام اختيار الدودة. يمكن إجراء مجموعة متنوعة من الاختيارات أو شراؤها للاستخدام مع C. elegans. يتم إجراء اللقطات بشكل شائع باستخدام طرف من البلاتين أو البلاتين / الإيريديوم ، مثبت في مقبض زجاجي أو معدني أو خشبي. يمكن صنع المقابض الزجاجية في المنزل عن طريق إذابة ماصة باستور حول سلك بلاتيني حتى يصبح السلك آمنا. يمكن العثور على معلومات إضافية حول تربية C. elegans ، بما في ذلك كيفية زراعة الديدان ومصادرها الغذائية والحفاظ عليها ، في WormBook5 ومصادر أخرى 6,7,8.
عند العمل مع C. elegans ، تستخدم تقنيات التعقيم عادة لمنع التلوث بالميكروبات والفطريات. ومن الأمثلة على تقنيات التعقيم تعقيم الأدوات، وتعقيم الكواشف، والقيام بالعمل في الحقول المعقمة. عادة ما يتم تعقيم مختارات الدودة باستخدام لهب مفتوح9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تعقيم الدودة التي تلتقط الديدان يحرق الديدان ، وبالتالي يمنع الخلط العرضي للسلالات عند العمل مع سلالات دودة متعددة. تتضمن الطرق النموذجية لتعقيم الدودة لهبا مفتوحا إما من موقد بنسن أو فانوس الإيثانول أو أخف وزنا قياسيا (الجدول 1). كنا متحمسين للبحث عن بدائل أكثر أمانا للطرق الموجودة في المختبر عندما قام طالب جامعي بسكب الإيثانول دون علم أثناء ملء فانوس الإيثانول وأشعل عن طريق الخطأ حريقا صغيرا عند إشعال الفانوس. لسوء الحظ ، تم الإبلاغ عن العديد من الحوادث باستخدام فوانيس الإيثانول10،11،12. لحسن الحظ ، تم التحقق من صحة طرق التعقيم البديلة لاستخدامها في علم الأحياء الدقيقة ، والغرض من هذه المقالة هو توضيح كيفية استخدام هذه المعدات لتعقيم الأدوات لاستخدامها مع C. elegans.
في مختبرات علم الأحياء الدقيقة ، تعد تقنية التعقيم مهمة أيضا. يتم تعقيم الحلقات والأسلاك المصلية المصنوعة من البلاتين إما باستخدام لهب مفتوح13 أو محرقة صغيرة14،15،16. تشمل الأسماء الأخرى للمحارق الدقيقة المعقمات الدقيقة أو محارق الباكتو. تشمل مزايا المحرقة الدقيقة على طرق اللهب التقليدية تقليل خطر الحريق ، والقضاء على تناثر المواد المحروقة ، والقدرة على العمل في غطاء محرك السيارة الرقائقي / خزانة السلامة الأحيائية 16،17،18. في الواقع ، توصي كل من الجمعية الأمريكية لعلم الأحياء الدقيقة ومنظمة الصحة العالمية باستخدام المحارق الدقيقة على استخدام اللهب المكشوف17،19،20. بالمقارنة مع شعلات بنسن ، لا تتطلب المحارق الدقيقة أيضا خط غاز ، والذي قد لا يكون لدى بعض المختبرات ، أو قد لا يكون موجودا في كل مقعد للطلاب لاستخدامه. مستوحاة من هذه المزايا ، تم تطوير بروتوكول لاستبدال استخدام اللهب بمحارق دقيقة لتعقيم الأدوات شائعة الاستخدام مثل اللقطات والملاعق والمشارط في مختبر C. elegans. قد تكون هذه الطريقة مناسبة للمدربين والباحثين الذين يسعون إلى تعزيز السلامة و / أو المرونة عند العمل مع C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans هو كائن حي نموذجي مناسب تماما للتمارين في مختبرات التدريس الجامعية. يوفر استخدام المحارق الدقيقة بدلا من اللهب المكشوف فوائد في كل من مختبرات الأبحاث ومختبرات الفصول الدراسية. في الواقع ، قد تشكل الدورات المختبرية الجامعية خطرا أكبر للحرائق العرضية نظرا لعدد العلماء المدربين حديثا في الغرفة. بالإضافة إلى ذلك ، يزداد خطر الحريق عند استخدام الإيثانول لتعقيم الأدوات بالقرب من مصدر اللهب لأن أبخرة الإيثانول قابلة للاشتعال. كما تمنح قابلية النقل ميزة للفصول الدراسية حيث لا يتم تركيب خطوط الغاز على كل مقعد. تم استخدام هذه الطريقة في مختبرات التدريس والبحث في مؤسستنا ، مما أدى إلى عدم حدوث زيادات في التلوث وعدم وقوع حوادث سلامة مختبرية منذ تأسيسها في عام 2016.
لضمان التوافق مع المحارق الدقيقة ، تم اختبار مجموعة من اللقطات ذات الحوامل المختلفة وتركيبات الأسلاك ومقاييس الأسلاك. تضمنت تركيبة الأسلاك 100٪ من البلاتين وكذلك 90٪ من البلاتين / 10٪ من الإيريديوم بسماكة سلكية تتراوح بين 30 و 32 جم ، وبغض النظر عن السمك والتركيب ، فإن طريقة التسخين لم تؤثر على سلامة الأسلاك. تضمنت الحوامل نوعين مختلفين من مقابض الالتقاط المتاحة تجاريا والحوامل الزجاجية المصنوعة في المنزل من ماصات باستور. لاحظ أن اللقطات لا تتوهج باللون الأحمر الساخن كما تفعل في اللهب. ومع ذلك ، لا يزال يتم تحقيق التعقيم الكافي طالما وصل المعقم إلى درجة الحرارة المناسبة. وبالتالي ، من الأهمية بمكان السماح للمحرقة الصغيرة بالإحماء لمدة 10 أو 20 دقيقة ، كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. يعد الاحتفاظ بالأداة في الغرفة لمدة 5 ثوان على الأقل لتحقيق التعقيم أمرا بالغ الأهمية أيضا. إن ترك الصك في الغرفة لفترة أطول من 7 ثوان لن يسبب ضررا للصك ولكنه غير ضروري. في حين أن هذا إجراء مباشر نسبيا مع الحد الأدنى من الخطوات ومن غير المرجح أن يحتاج إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، فقد يستغرق الأمر بعض الممارسة لتعلم تثبيت الأداة في البرميل دون لمس الجانبين.
من أجل استبدال اللهب المكشوف ، يجب أن تغطي طريقة التعقيم جميع التطبيقات المستخدمة في المختبر. بالإضافة إلى أدوات التعقيم ، قد تستخدم مختبرات C. elegans أيضا شعلات Bunsen لإنشاء حقل معقم للقيام بمهام أخرى مثل صب الألواح أو تلقيح الثقافات13. ومع ذلك ، سواء كان هذا يخلق حقلا معقما أو يجذب ملوثات لا تزال قابلة للحياة لا يزال مثيرا للجدل14. وعلى الرغم من أنه ليس خيارا في جميع المؤسسات، إلا أنه يمكن استخدام خزانة السلامة الأحيائية أو غطاء التدفق الرقائقي لهذه الأغراض، مما يسمح للمختبر بالعمل دون استخدام اللهب المفتوح. توصي كتيبات التعليمات لمعظم المحارق الدقيقة بعدم استخدامها لتعقيم شفرات المشرط لأن كشط الجدران الداخلية يضر بالمعقم. ومع ذلك ، إذا كنت تستخدم بعناية دليلا ، يمكن للمرء تعقيم شفرة مشرط أو ملعقة دون لمس الجدران الداخلية. وهذا يوسع نطاق استخدام هذه التقنية للسماح بالتقطيع دون استخدام اللهب ويسمح لمختبر C. elegans بالعمل دون تبديل التقنيات بين تعقيم الأشياء المختلفة.
وكما هو مبين في الجدول 1، توفر المحارق الدقيقة مزيدا من السلامة، وزيادة التوافق مع أغطية التدفق الرقائقي، وزيادة قابلية الحمل على الطرق القائمة على اللهب ولكن لها قيود. فهي أكثر تكلفة من الطرق الأخرى وتتطلب وقتا للإحماء قبل تحقيق درجات حرارة التعقيم. في الختام ، قد تكون هذه الطريقة التي تستخدم بشكل روتيني في العديد من مختبرات علم الأحياء الدقيقة قابلة للتطبيق في بعض مختبرات C. elegans البحثية والتعليمية التي تسعى إلى تحسين سلامة المختبرات دون المساس بالعقم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفان أن يعربا عن تقديرهما لسوزان هوارد وجاستن فين. تم تمويل هذا العمل من قبل قسم العلوم العصبية في كلية ويلسلي. تم توفير ديدان N2 من قبل CGC الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440). تم دعم رسوم النشر لهذه المقالة من قبل مكتبة كلية ويلسلي وصندوق الوصول المفتوح لخدمات التكنولوجيا.
Materials
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
- Attix, H., et al. Wild caught nematode identification and early embryo development: An accessible undergraduate research experience. microPublication Biology. 2021, (2021).
- Rose, J. K. Demonstrating connections between neuron signaling and behavior using C. elegans learning assays and optogenetics in a laboratory class. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 16 (3), 223-231 (2018).
- Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. Journal of Undergraduate Neuroscience Education: JUNE: A Publication of FUN, Faculty for Undergraduate Neuroscience. 15 (1), 44-55 (2016).
- Raley-Susman, K. M., Gray, J. M. Exploration of gerontogenes in the nervous system: a multi-level neurogenomics laboratory module for an intermediate neuroscience and behavior course. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 8 (2), 108-115 (2010).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e4019 (2012).
- JoVE. Biology I: yeast, Drosophilia, and C. Elegant. C. Elegans Maintenace. JoVE Science Education Database. , (2022).
- Hope, I. A. . C. elegans: A Practical Approach. , (1999).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with Worms: Caenorhabditis elegans as a Model Organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), 35 (2019).
- Waechter-Brulla, D. Improving safety in the microbiology laboratory through active learning and investigation. American Society for Microbiology. , (2000).
- Young, J. A. It says in the books that ethanol burns with a cool flame. Journal of Chemical Education. 77 (11), 1488 (2000).
- Mojtabai, F., Kaufman, J. A. . Learning by accident. V. 2. , (2005).
- JoVE. General Laboratory Techniques. Introduction to the Bunsen Burner. JoVE Science Education Database. , (2022).
- Bykowski, T., Stevenson, B. Aseptic Technique. Current Protocols in Microbiology. 56 (1), 98 (2020).
- Katz, D. S. The streak plate protocol. American Society for Microbiology Laboratory Protocols. , (2008).
- Public Health Agency of Canada. Agency of Canada Canadian Biosafety Handbook. Government of Canada. , (2016).
- Emmert, E. A. B. ASM Task Committee on Laboratory Biosafety Biosafety guidelines for handling microorganisms in the teaching laboratory: development and rationale. Journal of Microbiology & Biology Education. 14 (1), 78-83 (2013).
- Collins, C. H., Pal, S. B. Health Hazards in Microbiology. Handbook of Laboratory Health and Safety Measures. , (1990).
- Laboratory Biosafety Manual. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/I/item/9789240011311 (2020)
- Fleming, D. O. Laboratory Safety Principles and Practices. American Society for Microbiology. , (1995).
- Gordon, R. C., Davenport, C. V. Simple modification to improve usefulness of the Bacti-Cinerator. Applied Microbiology. 26 (3), 423 (1973).
- Cold Spring Harbor. LB (Luria-Bertani) liquid medium. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Cold Spring Harbor. Media containing agar or agarose. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
