Un método libre de llama para esterilizar púas, espátulas y bisturíes de C. elegans
Summary
Este artículo describe un método para esterilizar picos de gusanos, espátulas y bisturíes utilizando un microincinerador en lugar de una llama abierta.
Abstract
Caenorhabtidis elegans (C. elegans) es un organismo modelo óptimo para la investigación y la educación en instituciones principalmente de pregrado. Los estudiantes universitarios pueden aprender rápidamente la técnica estéril requerida para mantener los cultivos de C. elegans . La esterilización de los picos de platino utilizados para transferir gusanos de una placa a otra se realiza tradicionalmente manteniendo la púa en una llama de un quemador Bunsen o una linterna de etanol. Sin embargo, los quemadores Bunsen requieren una fuente de gas, y ambos equipos representan el riesgo de incendio accidental asociado con una llama abierta. Aquí se demuestra una técnica para esterilizar picos de gusanos, espátulas y bisturíes utilizando un microincinerador de bucle bacteriológico infrarrojo. Este equipo requiere solo una toma de corriente eléctrica y minimiza los posibles riesgos de incendio. Al reducir el riesgo y los requisitos de gas, esta técnica es muy adecuada para la investigación y la enseñanza en un entorno de pregrado.
Introduction
El organismo modelo C. elegans es muy adecuado tanto para la investigación como para la educación en instituciones principalmente de pregrado (PUI) debido al bajo costo, la facilidad de mantenimiento y la gama de aplicaciones 1,2,3,4. Para manejar gusanos, por ejemplo, para mover un gusano de una placa a otra, los experimentadores pueden usar una selección de gusanos. Se puede hacer o comprar una variedad de selecciones para su uso con C. elegans. Las púas se hacen más comúnmente con una punta de platino o platino / iridio, montada en un mango de vidrio, metal o madera. Los mangos de vidrio se pueden hacer internamente derritiendo una pipeta Pasteur alrededor de un alambre de platino hasta que el cable esté seguro. Se puede encontrar información adicional sobre la cría de C. elegans, incluida la forma de cultivar y mantener gusanos y sus fuentes de alimentos, en WormBook5 y otras fuentes 6,7,8.
Cuando se trabaja con C. elegans, las técnicas asépticas se utilizan típicamente para prevenir la contaminación con microbios y hongos. Ejemplos de técnicas asépticas incluyen la esterilización de instrumentos, el autoclave de reactivos y la realización de trabajos en campos estériles. Las púas de gusanos generalmente se esterilizan con una llama abierta9. Además, la esterilización del gusano incinera los gusanos, evitando así confusiones accidentales de cepas cuando se trabaja con múltiples cepas de gusanos. Los métodos típicos para esterilizar las púas de gusanos implican una llama abierta de un quemador Bunsen, una linterna de etanol o un encendedor estándar (Tabla 1). Nos motivaron a buscar alternativas más seguras a los métodos existentes en el laboratorio cuando un estudiante de pregrado, sin saberlo, derramó etanol mientras llenaba una linterna de etanol y accidentalmente inició un pequeño incendio al encender la linterna. Desafortunadamente, se han reportado muchos accidentes usando linternas de etanol 10,11,12. Afortunadamente, los métodos alternativos de esterilización han sido validados para su uso en microbiología, y el propósito de este artículo es demostrar cómo usar este equipo para esterilizar instrumentos para su uso con C. elegans.
En los laboratorios de microbiología, la técnica aséptica también es crítica. Los bucles serológicos y los alambres de platino se esterilizan utilizando una llama abierta13 o un microincinerador 14,15,16. Otros nombres para micro-incineradores incluyen micro-esterilizadores o bacto-incineradores. Las ventajas del microincinerador sobre los métodos tradicionales de llama incluyen la reducción del riesgo de incendio, la eliminación de salpicaduras de materiales incinerados y la capacidad de trabajar en una campana de flujo laminar / gabinete de bioseguridad 16,17,18. De hecho, tanto la Sociedad Americana de Microbiología como la Organización Mundial de la Salud recomiendan el uso de microincinerales sobre el uso de una llama abierta 17,19,20. En comparación con los quemadores Bunsen, los microincineradores tampoco requieren una línea de gas, que algunos laboratorios podrían no tener, o podrían no haber ubicado en cada banco para que los estudiantes la usen. Inspirado por estas ventajas, se desarrolló un protocolo para reemplazar el uso de llama con microincinerales para la esterilización de instrumentos de uso común como picos, espátulas y bisturíes en el laboratorio de C. elegans. Este método puede ser apropiado para instructores e investigadores que buscan mejorar la seguridad y / o flexibilidad cuando trabajan con C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans es un organismo modelo muy adecuado para ejercicios en laboratorios de enseñanza de pregrado. El uso de microincineradores en lugar de llamas abiertas proporciona beneficios tanto en los laboratorios de investigación como en los laboratorios de aula. De hecho, los cursos de laboratorio de pregrado pueden representar un mayor riesgo de incendios accidentales dado el número de científicos recién capacitados en la sala. Además, el riesgo de incendio aumenta cuando se usa etanol para esterilizar instrumentos cerca de la fuente de llama, ya que los vapores de etanol son inflamables. La portabilidad también confiere una ventaja para las aulas donde no se instalan líneas de gas en cada banco. Este método se ha empleado en laboratorios de docencia e investigación de nuestra institución, resultando en ningún aumento de la contaminación y cero accidentes de seguridad de laboratorio desde su incorporación en 2016.
Para garantizar la compatibilidad con los microincineradores, se probó una gama de púas con diferentes montajes, composiciones de cables y medidores de cables. La composición del alambre incluía 100% de platino, así como 90% de platino / 10% de iridio con un espesor de alambre de 30-32 G, e independientemente del grosor y la composición, el método de calentamiento no comprometió la integridad del cable. Los montajes incluían dos tipos diferentes de asas de pico disponibles comercialmente y montajes de vidrio hechos internamente de pipetas Pasteur. Tenga en cuenta que las púas no brillan al rojo vivo como lo hacen en la llama. Sin embargo, todavía se logra una esterilización suficiente siempre que el esterilizador haya alcanzado la temperatura adecuada. Por lo tanto, es fundamental permitir que el microincinerador se caliente durante 10 o 20 minutos, como se indica en las instrucciones del fabricante. Mantener el instrumento en la cámara durante al menos 5 s para lograr la esterilización también es crítico. Dejar el instrumento en la cámara por más de 7 s no causará daño al instrumento, pero es innecesario. Si bien este es un procedimiento relativamente sencillo con pasos mínimos y es poco probable que necesite solución de problemas, puede tomar algo de práctica aprender a estabilizar el instrumento en el cañón sin tocar los lados.
Para reemplazar una llama abierta, un método de esterilización debe cubrir todas las aplicaciones utilizadas en un laboratorio. Además de esterilizar instrumentos, los laboratorios de C. elegans también pueden utilizar quemadores Bunsen para crear un campo estéril para realizar otras tareas como verter placas o inocular cultivos13. Sin embargo, si esto crea un campo estéril o atrae contaminantes aún viables sigue siendo controvertido14. Aunque no es una opción en todas las instituciones, se puede utilizar un gabinete de bioseguridad o una campana de flujo laminar para estos fines, lo que permite que un laboratorio funcione sin el uso de llamas abiertas. Los manuales de instrucciones para la mayoría de los microincineradores recomiendan no usar para la esterilización de cuchillas de bisturí porque el raspado de las paredes internas daña el esterilizador. Sin embargo, si se usa cuidadosamente una guía, se puede esterilizar una cuchilla de bisturí o espátula sin tocar las paredes internas. Esto extiende el uso de la técnica para permitir el chunking sin usar una llama y permite que un laboratorio de C. elegans funcione sin cambiar las técnicas entre esterilizar diferentes objetos.
Como se describe en la Tabla 1, los microincineradores ofrecen una mayor seguridad, una mayor compatibilidad con las campanas de flujo laminar y una mayor portabilidad sobre los métodos basados en llamas, pero tienen limitaciones. Son más costosos que los otros métodos y requieren un tiempo de calentamiento antes de que se alcancen las temperaturas de esterilización. En conclusión, este método, que se utiliza habitualmente en muchos laboratorios de microbiología, puede ser aplicable en algunos laboratorios de investigación y enseñanza de C. elegans que buscan mejorar la seguridad del laboratorio sin comprometer la esterilidad.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer a Suzanne Howard y Justin Finne. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Neurociencia de Wellesley College. Los gusanos N2 fueron proporcionados por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Las tarifas de publicación de este artículo fueron apoyadas por el Wellesley College Library and Technology Services Open Access Fund.
Materials
| 90% platinum 10% iridium wire | Tritech | PT-9010 | Other sources and wire compositions may be used. |
| Agarose | Sigma Aldrich | A6013 | LB agar ingredient |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 50-110-1225 | Other Bunsen burners may be used |
| Ethanol Lamp | Carolina | 706604 | Included here as a reference to Table 1 |
| Lighter | Carolina | 706636 | Included here as a reference to Table 1 |
| Loop holder accessory | Fisher | 22-630-002 | Referred to in the manuscript as "guide" |
| Micro-incinerator | Thomas Scientific | 1154J15 | There are many companies that sell similar equipment. Similar models also sold by Benchmark Scientific (B1001), Fisher Scientific (22-630-001), Carolina (703400), and BT Lab Systems (BT1702). |
| N2 worms | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB ingredient |
| OP50 E. coli | CGC | OP50 | |
| Petri dish | Fisher | 08-772B | |
| Pick handle | Tritech | TWPH1 | |
| Scalpel blade | Fisher | 12-000-161 | |
| Scalpel handle | Fisher | 12-000-164 | |
| Spatula | Fisher | 14-374 | Other spatulas will work |
| Sterile cell spreaders | VWR | 76206-438 | Other cell spreaders may be used as long as they are sterile |
| Tryptone | Sigma Aldrich | T7293 | LB ingredient |
| Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y1625 | LB ingredient |
References
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