Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi
Summary
Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.
Abstract
Dinamik füzyon gözenek açma ve kapama ekzositoz ve endositoza aracılık eder ve kinetiklerini belirler. Burada, konfokal mikroskopinin, primer kültür sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için yama-kelepçe kaydı ile kombinasyon halinde nasıl kullanıldığı ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Üç füzyon modu arasında 1) füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapatılmasını içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profilin plazma zarında tamamen birleşene kadar büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.
Bu füzyon modlarını tespit etmek için, plazma membranı, plazma zarının sitosol yüzlü broşüründe fosfatidilinositol-4,5-bisfosfata (PtdIns (4,5) P2) bağlanan fosfolipaz C δ (PH-mNG) PH alanı ile tutturulmuş mNeonGreen’i aşırı eksprese ederek etiketlendi; veziküller, veziküler içerik salınımını tespit etmek için floresan yanlış nörotransmitter FFN511 ile yüklendi; ve Atto 655, füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine dahil edildi. Bu üç floresan prob, füzyon gözenek açıklığını, içerik salınımını, füzyon gözenek kapanmasını ve kaynaştırma vezikül boyutu değişikliklerini tespit etmek için canlı kromafin hücrelerinde kare başına ~ 20-90 ms’de aynı anda görüntülendi. Analiz yöntemi, üç füzyon modunu bu floresan ölçümlerinden ayırt etmek için tanımlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, prensip olarak, kromafin hücrelerinin ötesindeki birçok salgı hücresine uygulanabilir.
Introduction
Membran füzyonu, sinaptik iletim, kan şekeri homeostazı, immün yanıt ve viral giriş 1,2,3 dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyona aracılık eder. Plazma zarında vezikül füzyonunu içeren ekzositoz, nöronal ağ aktiviteleri gibi birçok önemli fonksiyona ulaşmak için nörotransmitterleri ve hormonları serbest bırakır. Füzyon, veziküler içeriği serbest bırakmak için bir gözenek açar, bundan sonra gözenek, öp ve çalıştır 1,4 olarak adlandırılan kaynaştırıcı vezikülü almak için kapanabilir. Hem geri dönüşümsüz hem de geri dönüşümlü füzyon gözenek açıklığı, tek vezikül füzyonunun füzyon gözenek iletkenlik kayıtlarıyla birleştirilen hücreye bağlı kapasitans kayıtları ile ölçülebilir.
Bu genellikle kaynaştırıcı vezikülün düzleşmesine kadar füzyonun genişlemesini içeren tam çökme füzyonunu ve füzyon gözenek açma ve kapama işlemini içeren öpüşme ve koşmayı içeren, sırasıyla 5,6,7,8,9,10,11,12,13 olarak yorumlanır. . Kromafin hücrelerinde yapılan son konfokal ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme çalışmaları, füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapanmasını (öp ve çalıştır, yakın füzyon olarak da adlandırılır), uzun süre açık gözenekli bir Ω şeklini koruyan füzyon gözenek açıklığını, kalış-füzyon olarak adlandırılan füzyon gözenek açıklığını ve kaynaştırıcı vezikülün plazma zarı ile birleşene kadar küçülmesini doğrudan gözlemlemiştir. 8,14,15,16,17.
Nöronlarda, füzyon gözeneklerinin açılması ve kapanması, füzyon gözeneklerinden daha büyük veziküllere önceden yüklenmiş kuantum noktalarının salınımını gösteren görüntüleme ve sinir terminallerininsalınım yüzünde füzyon gözenek iletkenlik ölçümleri ile tespit edilmiştir 5,18,19. Adrenal kromafin hücreleri, ekzo- ve endositoz20,21’in incelenmesi için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kromafin hücreleri büyük yoğun çekirdekli veziküller içermesine rağmen, sinapslar küçük sinaptik veziküller içerirken, kromafin hücrelerinde ve sinapslarda ekzositoz ve endositoz proteinleri oldukça benzerdir 10,11,12,20,21,22,23.
Burada, sığır adrenal kromafin hücrelerinde elektrofizyoloji ile kombine konfokal görüntüleme yöntemi kullanılarak bu üç füzyon modunu ölçmek için bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 1). Bu yöntem, ekzositozu tespit etmek için floresan sahte nörotransmitterlerin (FFN511) veziküllere yüklenmesini içerir; füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profili doldurmak için banyo çözeltisine Atto 655 (A655) eklenmesi ve plazma zarının, plazma zarı 8,15,24’te PtdIns(4,5)P 2’ye bağlanan fosfolipaz Cδ’nin (PH) PH alanı ile etiketlenmesi. Füzyon gözenek dinamikleri, farklı floresan yoğunluklarındaki değişikliklerle tespit edilebilir. Kromafin hücreleri için tanımlanmış olmasına rağmen, burada açıklanan bu yöntemin prensibi, kromafin hücrelerinin çok ötesinde birçok salgı hücresine yaygın olarak uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Füzyon gözenek ve transmitter salınımının dinamiklerini ve ayrıca sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu, yakın füzyonu, stay-füzyonu ve shrink-füzyonu tespit etmek için konfokal mikroskobik görüntüleme yöntemi tanımlanmıştır 4,24. Hücreyi depolarize etmek ve böylece ekzo- ve endositozu uyandırmak için elektrofizyolojik bir yöntem tanımlanmıştır. Sistematik konfokal görüntü işleme, füzyon ve fisyon olayları …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmayı destekledikleri için NINDS Intramural Araştırma Programlarına (ZIA NS003009-13 ve ZIA NS003105-08) teşekkür ederiz.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
