Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten
Summary
Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.
Abstract
Dynamische fusieporieopening en -sluiting bemiddelen exocytose en endocytose en bepalen hun kinetiek. Hier wordt in detail gedemonstreerd hoe confocale microscopie werd gebruikt in combinatie met patch-clamp-opname om drie fusiemodi in primaire cultuur bovine adrenal chromaffine cellen te detecteren. De drie fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken is, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij het fusie-gegenereerde Ω-vormige profiel krimpt totdat het volledig samensmelt bij het plasmamembraan.
Om deze fusiemodi te detecteren, werd het plasmamembraan gelabeld door mNeonGreen te overexpresseren dat verbonden is met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH-mNG), dat bindt aan fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (PtdIns(4,5)P2) in de cytosolgerichte folder van het plasmamembraan; blaasjes werden geladen met de fluorescerende valse neurotransmitter FFN511 om vesiculaire inhoudsafgifte te detecteren; en Atto 655 werd opgenomen in de badoplossing om fusieporiënsluiting te detecteren. Deze drie fluorescerende sondes werden gelijktijdig in beeld gebracht met ~ 20-90 ms per frame in levende chromaffinecellen om fusieporieopening, inhoudsafgifte, fusieporiesluiting en veranderingen in de grootte van blaasjes te detecteren. De analysemethode wordt beschreven om drie fusiemodi van deze fluorescentiemetingen te onderscheiden. De hier beschreven methode kan in principe van toepassing zijn op veel secretoire cellen buiten chromaffinecellen.
Introduction
Membraanfusie bemiddelt veel biologische functies, waaronder synaptische transmissie, bloedglucosehomeostase, immuunrespons en virale entry 1,2,3. Exocytose, waarbij blaasjesfusie op het plasmamembraan betrokken is, geeft neurotransmitters en hormonen vrij om veel belangrijke functies te bereiken, zoals neuronale netwerkactiviteiten. Fusie opent een porie om vesiculaire inhoud vrij te maken, waarna de porie kan sluiten om het fuserende blaasje op te halen, dat kiss-and-run 1,4 wordt genoemd. Zowel onomkeerbare als omkeerbare fusieporieopening kan worden gemeten met celgebonden capaciteitsregistraties in combinatie met fusieporiegeleidingsopnamen van enkelvoudige blaasjesfusie.
Dit wordt vaak geïnterpreteerd als een weerspiegeling van volledige collapsfusie, waarbij de fusie wordt verwijd tot het afvlakken van het fuserende blaasje, en kiss-and-run, waarbij fusieporieopening en -sluiting betrokken zijn, respectievelijk 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recente confocale en gestimuleerde emissiedepletie (STED) beeldvormingsstudies in chromaffinecellen hebben direct waargenomen dat fusieporieopening en -sluiting (kiss-and-run, ook wel close-fusion genoemd), fusieporieopening die lange tijd een Ω-vorm met een open porie handhaaft, genaamd stay-fusion, en krimpen van het fuserende blaasje totdat het volledig samensmelt met het plasmamembraan, dat volledige fusie vervangt voor het samenvoegen van fuserende blaasjes met het plasmamembraan4, 8,14,15,16,17.
In neuronen zijn het openen en sluiten van fusieporiën gedetecteerd met beeldvorming die de afgifte laat zien van quantum dots die vooraf zijn geladen in blaasjes die groter zijn dan de fusieporie en met fusieporiegeleidingsmetingen aan het afgiftevlak van zenuwterminals 5,18,19. Bijnierchromaffinecellen worden veel gebruikt als model voor de studie van exo- en endocytose20,21. Hoewel chromaffinecellen grote blaasjes met dichte kern bevatten, terwijl synapsen kleine synaptische blaasjes bevatten, zijn de exocytose- en endocytose-eiwitten in chromaffinecellen en synapsen vrij analoog 10,11,12,20,21,22,23.
Hier wordt een methode beschreven om deze drie fusiemodi te meten met behulp van een confocale beeldvormingsmethode in combinatie met elektrofysiologie in boviene bijnierchromaffinecellen (figuur 1). Deze methode omvat het laden van fluorescerende valse neurotransmitters (FFN511) in blaasjes om exocytose te detecteren; toevoeging van Atto 655 (A655) in de badoplossing om het door fusie gegenereerde Ω-vormige profiel te vullen, en etikettering van het plasmamembraan met het PH-domein van fosfolipase C δ (PH), dat bindt aan PtdIns(4,5)P2 op het plasmamembraan 8,15,24. Fusieporiëndynamiek kan worden gedetecteerd door veranderingen in verschillende fluorescerende intensiteiten. Hoewel beschreven voor chromaffinecellen, kan het principe van deze hier beschreven methode op grote schaal worden toegepast op veel secretoire cellen ver buiten chromaffinecellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een confocale microscopische beeldvormingsmethode wordt beschreven om de dynamiek van fusieporie en zenderafgifte te detecteren, evenals drie fusiemodi, close-fusion, stay-fusion en shrink-fusion in bovine adrenal chromaffin cells 4,24. Een elektrofysiologische methode om de cel te depolariseren en daarbij exo- en endocytose op te roepen wordt beschreven. Systematische confocale beeldverwerking biedt informatie over verschillende vormen van poriegedrag voor fusie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de NINDS Intramurale Onderzoeksprogramma’s (ZIA NS003009-13 en ZIA NS003105-08) voor het ondersteunen van dit werk.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
