Summary

Microscopia confocale per misurare tre modalità di dinamica dei pori di fusione nelle cellule cromaffini surrenali

Published: March 16, 2022
doi:

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica di imaging confocale per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule cromaffini surrenali bovine. Queste modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l’apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l’apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione termoretraibile, che coinvolge il restringimento delle vescicole fuse.

Abstract

L’apertura e la chiusura dinamica dei pori di fusione mediano l’esocitosi e l’endocitosi e ne determinano la cinetica. Qui, è dimostrato in dettaglio come la microscopia confocale è stata utilizzata in combinazione con la registrazione patch-clamp per rilevare tre modalità di fusione nelle cellule surrenali surrenali bovine di coltura primaria. Le tre modalità di fusione includono 1) fusione ravvicinata (chiamata anche kiss-and-run), che coinvolge l’apertura e la chiusura dei pori di fusione, 2) la fusione di soggiorno, che coinvolge l’apertura dei pori di fusione e il mantenimento del poro aperto, e 3) la fusione di restringimento, che comporta il restringimento del profilo a forma di Ω generato dalla fusione fino a quando non si fonde completamente sulla membrana plasmatica.

Per rilevare queste modalità di fusione, la membrana plasmatica è stata etichettata sovraesprimendo mNeonGreen attaccato al dominio PH della fosfolipasi C δ (PH-mNG), che si lega al fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P2) sul foglietto rivolto verso il citosol della membrana plasmatica; le vescicole sono state caricate con il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 per rilevare il rilascio di contenuto vescicolare; e Atto 655 è stato incluso nella soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione. Queste tre sonde fluorescenti sono state fotografate simultaneamente a ~ 20-90 ms per fotogramma in cellule cromaffini vive per rilevare l’apertura dei pori di fusione, il rilascio di contenuto, la chiusura dei pori di fusione e la fusione dei cambiamenti delle dimensioni delle vescicole. Il metodo di analisi è descritto per distinguere tre modalità di fusione da queste misurazioni di fluorescenza. Il metodo qui descritto può, in linea di principio, applicarsi a molte cellule secretorie oltre le cellule cromaffini.

Introduction

La fusione di membrana media molte funzioni biologiche, tra cui la trasmissione sinaptica, l’omeostasi della glicemia, la risposta immunitaria e l’ingresso virale 1,2,3. L’esocitosi, che coinvolge la fusione delle vescicole sulla membrana plasmatica, rilascia neurotrasmettitori e ormoni per ottenere molte funzioni importanti, come le attività della rete neuronale. La fusione apre un poro per rilasciare il contenuto vescicolare, dopo di che il poro può chiudersi per recuperare la vescicola di fusione, che è chiamata kiss-and-run 1,4. Sia l’apertura irreversibile che reversibile dei pori di fusione può essere misurata con registrazioni di capacità collegate a celle combinate con registrazioni di conduttanza dei pori di fusione di fusione di singole vescicole.

Questo è spesso interpretato come riflesso della fusione a collasso completo, che comporta la dilatazione della fusione fino all’appiattimento della vescicola di fusione, e il bacio e la corsa, che comporta l’apertura e la chiusura dei pori di fusione, rispettivamente 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Recenti studi di imaging confocale e sted (STED) di emissioni confocali e stimolate in cellule cromaffini hanno osservato direttamente l’apertura e la chiusura dei pori di fusione (kiss-and-run, chiamata anche fusione ravvicinata), l’apertura dei pori di fusione che mantiene una forma Ω con un poro aperto per lungo tempo, definita fusione di soggiorno, e il restringimento della vescicola fondente fino a quando non si fonde completamente con la membrana plasmatica, che sostituisce la fusione della fusione delle vescicole con la membrana plasmatica4, 8,14,15,16,17.

Nei neuroni, l’apertura e la chiusura dei pori di fusione sono state rilevate con l’imaging che mostra il rilascio di punti quantici precaricati in vescicole più grandi del poro di fusione e con misurazioni della conduttanza dei pori di fusione sulla faccia di rilascio dei terminali nervosi 5,18,19. Le cellule cromaffini surrenali sono ampiamente utilizzate come modello per lo studio dell’eso- ed endocitosi20,21. Sebbene le cellule cromaffini contengano grandi vescicole a nucleo denso, mentre le sinapsi contengono piccole vescicole sinaptiche, le proteine di esocitosi ed endocitosi nelle cellule cromaffini e nelle sinapsi sono abbastanza analoghe 10,11,12,20,21,22,23.

Qui, viene descritto un metodo per misurare queste tre modalità di fusione utilizzando un metodo di imaging confocale combinato con l’elettrofisiologia nelle cellule cromaffini surrenali bovine (Figura 1). Questo metodo prevede il caricamento di falsi neurotrasmettitori fluorescenti (FFN511) nelle vescicole per rilevare l’esocitosi; aggiunta di Atto 655 (A655) nella soluzione bagno per riempire il profilo a forma di Ω generato dalla fusione ed etichettatura della membrana plasmatica con il dominio PH della fosfolipasi C δ (PH), che si lega a PtdIns(4,5)P2 alla membranaplasmatica 8,15,24. La dinamica dei pori di fusione può essere rilevata attraverso cambiamenti in diverse intensità fluorescenti. Sebbene descritto per le cellule cromaffini, il principio di questo metodo qui descritto può essere applicato ampiamente a molte cellule secretorie ben oltre le cellule cromaffini.

Protocol

NOTA: La procedura di utilizzo degli animali ha seguito le linee guida NIH ed è stata approvata dal NIH Animal Care and Use Committee. 1. Coltura cellulare cromaffini bovina Preparare la soluzione di Locke (Tabella 1) e gli strumenti in autoclave 1 giorno prima della coltura cellulare del cromaffinino. Ottenere ghiandole surrenali bovine da un mattatoio locale il giorno della coltura e tenerle immerse nella soluzione ghiacciata di Locke pr…

Representative Results

Seguendo le procedure sperimentali mostrate in Figura 1 e Figura 2, le cellule cromaffini delle ghiandole surrenali bovine sono state trasfettate con PH-mNG per etichettare la membrana plasmatica; A655 è stato aggiunto alla soluzione del bagno per rilevare la chiusura dei pori di fusione; e il falso neurotrasmettitore fluorescente FFN511 è stato caricato in vescicole per il rilevamento del rilascio. Successivamente, l’imaging timelapse confocale del piano XY d…

Discussion

Viene descritto un metodo di imaging microscopico confocale per rilevare la dinamica del rilascio dei pori di fusione e del trasmettitore, nonché tre modalità di fusione, fusione ravvicinata, fusione di permanenza e fusione di restringimento nelle cellule cromaffini surrenali bovine 4,24. Viene descritto un metodo elettrofisiologico per depolarizzare la cellula e quindi evocare l’eso- e l’endocitosi. L’elaborazione sistematica delle immagini confocali fornisce …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i programmi di ricerca intramurale NINDS (ZIA NS003009-13 e ZIA NS003105-08) per aver sostenuto questo lavoro.

Materials

Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187-500MG ATP for preparing internal solution
Atto 655 ATTO-TEC GmbH AD 655-21 Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons Lonza VSPI-1003 Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette Warner Instruments 64-0795 Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin Sigma A2153-50G Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M Quality Biological 351-130-721 Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm Falcon 352360 Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution Sigma 232041 Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P Sigma 1.1214E+10 Enzyme for gland digestion
Coverslip Neuvitro GG-14-Laminin GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose Sigma G8270-1KG Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM ThermoFisher Scientific 11885092 Reagent for preparing culture medium
EGTA Sigma 324626-25GM Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector Amaxa Biosystems Nucleofector II Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum ThermoFisher Scientific 10082147 Reagent for preparing culture medium
FFN511 Abcam ab120331 Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877-250MG GTP for preparing internal solution
HEPES Sigma H3375-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software Leica LAS X software Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope Leica Leica TCS SP5 Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid Sigma 49449-100G Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier Heka Lock-in Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M Quality Biological 351-033-721EA Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line Hausser Scientific 3120 Counting chamber
Microforge Narishige MF-830 Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm Millipore SLGPR33RB Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen) Allele Biotechnology ABP-FP-MNEONSB Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron EIKO filtering co 03-100/32 Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10 Heka EPC-10 Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP Addgene Plasmid #51407 Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller Sutter Instrument P-97 Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride Sigma P5404-500G Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software Heka Pulse Software for patch-clamp data collection
Recording chamber Warner Instruments 64-1943/QR-40LP coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride Sigma S7653-1KG Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide Sigma S5881-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic Sigma S8282-500G Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate Barnsted/Thermolyne type 10100 Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL Becton Dickinson 302832 Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride Sigma T2265-100G TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor Sigma T9253-5G Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid Leica 195371-10-9 Leica confocal mounting oil

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Cite This Article
Han, S., Wang, X., Cordero, N., Wu, L. Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells. J. Vis. Exp. (181), e63569, doi:10.3791/63569 (2022).

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