المجهر البؤري لقياس ثلاثة أنماط من ديناميكيات مسام الانصهار في خلايا الكرومافين الكظرية
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية تصوير متحدة البؤرة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية. تشمل أوضاع الاندماج هذه 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والتشغيل) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الانصهار ، 2) الاندماج ، الذي ينطوي على فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار الانكماشي ، الذي ينطوي على انكماش الحويصلة المنصهرة.
Abstract
يتوسط فتح وإغلاق المسام الانصهارية الديناميكية الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية وتحديد حركياتها. هنا ، يتضح بالتفصيل كيف تم استخدام المجهر البؤري في تركيبة مع تسجيل المشبك الرقعة للكشف عن ثلاثة أوضاع اندماج في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية في الزراعة الأولية. تشمل أوضاع الاندماج الثلاثة 1) الانصهار الوثيق (ويسمى أيضا القبلة والجري) ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، 2) الاندماج المتبقي ، الذي يتضمن فتح مسام الاندماج والحفاظ على المسام المفتوحة ، و 3) الانصهار المتقلص ، الذي ينطوي على انكماش ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الاندماج حتى يندمج تماما في غشاء البلازما.
للكشف عن أوضاع الاندماج هذه ، تم تسمية غشاء البلازما عن طريق الإفراط في التعبير عن mNeonGreen المرتبط بمجال الأس الهيدروجيني للفوسفوليباز C δ (PH-mNG) ، والذي يرتبط بالفوسفاتيديلينوسيتول-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) في النشرة المواجهة للسيتوسول من غشاء البلازما. تم تحميل الحويصلات بالناقل العصبي الكاذب الفلورسنت FFN511 للكشف عن إطلاق المحتوى الحويصلي. وتم تضمين Atto 655 في محلول الحمام للكشف عن إغلاق مسام الانصهار. تم تصوير هذه المجسات الفلورية الثلاثة في وقت واحد عند ~ 20-90 مللي ثانية لكل إطار في خلايا الكرومافين الحية للكشف عن فتح مسام الاندماج ، وإطلاق المحتوى ، وإغلاق مسام الاندماج ، وتغيرات حجم الحويصلة المنصهرة. تم وصف طريقة التحليل للتمييز بين ثلاثة أوضاع اندماج من قياسات التألق هذه. يمكن أن تنطبق الطريقة الموصوفة هنا ، من حيث المبدأ ، على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.
Introduction
يتوسط الاندماج الغشائي العديد من الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك الانتقال المشبكي ، وتوازن الجلوكوز في الدم ، والاستجابة المناعية ، والدخول الفيروسي1،2،3. إفراز الخلايا الخارجية ، الذي ينطوي على اندماج الحويصلة في غشاء البلازما ، يطلق الناقلات العصبية والهرمونات لتحقيق العديد من الوظائف الهامة ، مثل أنشطة الشبكة العصبية. يفتح الانصهار مسام لإطلاق محتويات حويصلية ، وبعد ذلك قد تغلق المسام لاسترداد الحويصلة المنصهرة ، والتي تسمى قبلة وتشغيل 1,4. يمكن قياس كل من فتحة مسام الاندماج التي لا رجعة فيها وعكسها باستخدام تسجيلات السعة المرفقة بالخلايا جنبا إلى جنب مع تسجيلات توصيل مسام الاندماج لاندماج حويصلة واحدة.
غالبا ما يفسر هذا على أنه يعكس اندماج كامل الانهيار ، بما في ذلك تمدد الاندماج حتى تسطيح حويصلة الصمامات ، والتقبيل والتشغيل ، بما في ذلك فتح وإغلاق مسام الاندماج ، على التوالي5،6،7،8،9،10،11،12،13 . لاحظت الدراسات التصويرية الحديثة لاستنفاد الانبعاثات البؤرية والمحفزة (STED) في خلايا الكرومافين مباشرة فتح وإغلاق مسام الاندماج (قبلة وتشغيل ، وتسمى أيضا الانصهار القريب) ، وفتح مسام الاندماج الذي يحافظ على شكل Ω مع مسام مفتوحة لفترة طويلة ، يسمى الاندماج المتبقي ، وتقلص حويصلة الصمامات حتى تكتمل مع غشاء البلازما ، الذي يحل محل الاندماج الكامل لدمج الحويصلات الاندماجية مع غشاء البلازما4 ، 8,14,15,16,17.
في الخلايا العصبية، تم الكشف عن فتح وإغلاق مسام الاندماج مع التصوير الذي يظهر إطلاق النقاط الكمومية المحملة مسبقا في الحويصلات التي هي أكبر من مسام الاندماج ومع قياسات توصيل مسام الاندماج في وجه إطلاق المحطات العصبية5،18،19. تستخدم خلايا الكرومافين الكظرية على نطاق واسع كنموذج لدراسة كثرة الخلايا الخارجية والداخلية20,21. على الرغم من أن خلايا الكرومافين تحتوي على حويصلات كبيرة كثيفة النواة ، في حين أن المشابك العصبية تحتوي على حويصلات متشابكة صغيرة ، فإن بروتينات الإفرازات الخارجية وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا الكرومافين والمشابك العصبية متشابهة تماما 10,11,12,20,21,22,23.
هنا ، يتم وصف طريقة لقياس أوضاع الاندماج الثلاثة هذه باستخدام طريقة تصوير متحدة البؤرة جنبا إلى جنب مع الفيزيولوجيا الكهربية في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية (الشكل 1). تتضمن هذه الطريقة تحميل الناقلات العصبية الكاذبة الفلورية (FFN511) في الحويصلات للكشف عن الإفرازات الخارجية. إضافة Atto 655 (A655) في محلول الحمام لملء ملف تعريف Ω الشكل المتولد عن الانصهار ، ووضع علامات على غشاء البلازما مع مجال PH من δ الفوسفوليباز C (PH) ، والذي يرتبط ب PtdIns(4,5)P2 في غشاء البلازما 8,15,24. يمكن الكشف عن ديناميكيات المسام الانصهارية من خلال التغيرات في كثافة الفلورسنت المختلفة. على الرغم من وصفها لخلايا الكرومافين ، إلا أن مبدأ هذه الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقه على نطاق واسع على العديد من الخلايا الإفرازية خارج خلايا الكرومافين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم وصف طريقة التصوير المجهري البؤري للكشف عن ديناميكيات مسام الاندماج وإطلاق جهاز الإرسال ، بالإضافة إلى ثلاثة أوضاع اندماج ، اندماج وثيق ، اندماج البقاء ، وانكماش الانصهار في خلايا كرومافين الغدة الكظرية البقرية 4,24. يتم وصف طريقة الفيزيولوجيا الكهربية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر برامج البحوث الداخلية NINDS (ZIA NS003009-13 و ZIA NS003105-08) على دعم هذا العمل.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
