Конфокальная микроскопия для измерения трех режимов динамики пор слияния в хромафинных клетках надпочечников
Summary
Этот протокол описывает метод конфокальной визуализации для обнаружения трех режимов слияния в хромаффинных клетках надпочечников крупного рогатого скота. Эти режимы слияния включают в себя 1) тесное слияние (также называемое поцелуем и бегом), включающее открытие и закрытие пор слияния, 2) слияние пор, включающее открытие пор слияния и поддержание открытой поры, и 3) термоядерное слияние, включающее усадку плавленого пузырька.
Abstract
Динамическое сращение пор, открытие и закрытие опосредуют экзоцитоз и эндоцитоз и определяют их кинетику. Здесь подробно показано, как конфокальная микроскопия использовалась в сочетании с записью патч-зажима для обнаружения трех режимов слияния в первичной культуре хромафинных клеток надпочечников крупного рогатого скота. Три режима синтеза включают в себя 1) близкий синтез (также называемый поцелуем и бегом), включающий открытие и закрытие пор синтеза, 2) термоядерный синтез, включающий открытие пор синтеза и поддержание открытой поры, и 3) термоусадочный синтез, включающий усадку профиля Ω формы, генерируемого синтезом, пока он полностью не сольется в плазматической мембране.
Для обнаружения этих режимов слияния плазматическую мембрану мечили путем сверхэкспрессии mNeonGreen, присоединенного к PH-домену фосфолипазы C δ (PH-mNG), который связывается с фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфатом (PtdIns(4,5)P2) на цитозольном листке плазматической мембраны; везикулы нагружали флуоресцентным ложным нейротрансмиттером FFN511 для обнаружения высвобождения везикулярного содержимого; и Atto 655 был включен в раствор ванны для обнаружения закрытия пор слияния. Эти три флуоресцентных зонда были изображены одновременно со скоростью ~ 20-90 мс на кадр в живых хромаффинных клетках для обнаружения открытия пор слияния, высвобождения содержимого, закрытия пор слияния и изменения размера пузырьков плавления. Описан метод анализа, чтобы отличить три режима синтеза от этих флуоресцентных измерений. Метод, описанный здесь, может, в принципе, применяться ко многим секреторным клеткам за пределами хромаффинных клеток.
Introduction
Слияние мембран опосредует многие биологические функции, включая синаптическую передачу, гомеостаз глюкозы в крови, иммунный ответ и проникновение вируса 1,2,3. Экзоцитоз, включающий слияние пузырьков на плазматической мембране, высвобождает нейротрансмиттеры и гормоны для достижения многих важных функций, таких как активность нейронной сети. Слияние открывает пору для высвобождения везикулярного содержимого, после чего пора может закрыться, чтобы извлечь сливающийся пузырь, который называется поцелуем и бегом 1,4. Как необратимое, так и обратимое открытие пор слияния может быть измерено с помощью прикрепленных к клеткам емкостных записей в сочетании с записями проводимости пор слияния одиночных пузырьков.
Это часто интерпретируется как отражение полного коллапса слияния, включающего расширение слияния до сплющивания плавящегося пузырька, и поцелуй и бег, включающий открытие и закрытие пор слияния, соответственно 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Недавние исследования конфокальной и стимулированной эмиссионной недостаточности (STED) в хромаффинных клетках непосредственно наблюдали открытие и закрытие пор слияния (kiss-and-run, также называемое близким слиянием), открытие пор слияния, которое поддерживает форму Ω с открытой порой в течение длительного времени, терминальное стай-слияние и сжатие плавящегося пузырька до тех пор, пока он полностью не сольется с плазматической мембраной, которая заменяет полный коллапс слияния для слияния плавящихся пузырьков с плазматической мембраной4, 8,14,15,16,17.
В нейронах открытие и закрытие пор слияния были обнаружены с помощью визуализации, показывающей высвобождение квантовых точек, предварительно загруженных в везикулы, которые больше, чем пора слияния, и с измерениями проводимости пор слияния на поверхности высвобождения нервных окончаний 5,18,19. Хромаффинные клетки надпочечников широко используются в качестве модели для изучения экзо- и эндоцитоза20,21. Хотя хромаффинные клетки содержат большие везикулы с плотным ядром, тогда как синапсы содержат небольшие синаптические везикулы, белки экзоцитоза и эндоцитоза в хромафинных клетках и синапсах весьма аналогичны 10,11,12,20,21,22,23.
Здесь описан способ измерения этих трех режимов слияния с использованием конфокального метода визуализации в сочетании с электрофизиологией в хромаффинных клетках надпочечников крупного рогатого скота (рисунок 1). Этот метод включает загрузку флуоресцентных ложных нейротрансмиттеров (FFN511) в везикулы для выявления экзоцитоза; добавление Atto 655 (A655) в раствор ванны для заполнения сгенерированного слиянием Ω-образного профиля и маркировка плазматической мембраны с доменом PH фосфолипазы C δ (PH), который связывается с PtdIns(4,5)P2 на плазматической мембране 8,15,24. Динамика пор синтеза может быть обнаружена путем изменения различных интенсивностей флуоресцентной жидкости. Несмотря на то, что принцип этого метода описан для хромаффинных клеток, описанный здесь, может быть широко применен ко многим секреторным клеткам далеко за пределами хромаффинных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описан конфокальный микроскопический метод визуализации для обнаружения динамики слияния пор и высвобождения трансмиттера, а также трех режимов слияния: близкого слияния, остаточного слияния и усадки-слияния в хромафинных клетках надпочечников крупного рогатого скота <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим программы внутренних исследований NINDS (ZIA NS003009-13 и ZIA NS003105-08) за поддержку этой работы.
Materials
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187-500MG | ATP for preparing internal solution |
| Atto 655 | ATTO-TEC GmbH | AD 655-21 | Atto dye to label bath solution |
| Basic Nucleofector for Primary Neurons | Lonza | VSPI-1003 | Electroporation transfection buffer along with kit |
| Boroscilicate capillary glass pipette | Warner Instruments | 64-0795 | Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | Reagent for gland digestion |
| Calcium Chloride 2 M | Quality Biological | 351-130-721 | Reagent for preparing bath solution |
| Cell Strainers, 100 µm | Falcon | 352360 | Material for filtering chromaffin cell suspension |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer |
| Collagenase P | Sigma | 1.1214E+10 | Enzyme for gland digestion |
| Coverslip | Neuvitro | GG-14-Laminin | GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885092 | Reagent for preparing culture medium |
| EGTA | Sigma | 324626-25GM | Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution |
| Electroporation and Nucleofector | Amaxa Biosystems | Nucleofector II | Transfect plasmids into cells |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10082147 | Reagent for preparing culture medium |
| FFN511 | Abcam | ab120331 | Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877-250MG | GTP for preparing internal solution |
| HEPES | Sigma | H3375-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation |
| Leica Application Suite X software | Leica | LAS X software | Confocal software for imaging data collection and analysis |
| Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope | Leica | Leica TCS SP5 | Confocal microscope for imaging data collection |
| L-Glutamic acid | Sigma | 49449-100G | Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution |
| Lock-in amplifier | Heka | Lock-in | Software for capacitance recording |
| Magnesium Chloride 1 M | Quality Biological | 351-033-721EA | Reagent for preparing internal solution and bath solution |
| Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line | Hausser Scientific | 3120 | Counting chamber |
| Microforge | Narishige | MF-830 | Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Millipore | SLGPR33RB | Material for glands wash and digestion |
| mNG(mNeonGreen) | Allele Biotechnology | ABP-FP-MNEONSB | Template for PH-mNeonGreen construction |
| Nylon mesh filtering screen 100 micron | EIKO filtering co | 03-100/32 | Material for filtering medulla suspension |
| Patch clamp EPC-10 | Heka | EPC-10 | Amplifier for patch-clamp data collection |
| PH-EGFP | Addgene | Plasmid #51407 | Backbone for PH-mNeonGreen construction |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Make pipettes for patch-clamp recording |
| Potassium Chloride | Sigma | P5404-500G | Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution |
| Pulse software | Heka | Pulse | Software for patch-clamp data collection |
| Recording chamber | Warner Instruments | 64-1943/QR-40LP | coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells |
| Sodium chloride | Sigma | S7653-1KG | Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S8282-500G | Reagent for preparing Locke’s solution |
| Stirring hot plate | Barnsted/Thermolyne | type 10100 | Heater for pipette coating with wax |
| Syringe, 30 mL | Becton Dickinson | 302832 | Material for glands wash and digestion |
| Tetraethylammonium chloride | Sigma | T2265-100G | TEA for preparing bath solution |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253-5G | Reagent for gland digestion |
| Type F Immersion liquid | Leica | 195371-10-9 | Leica confocal mounting oil |
References
- Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
- Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
- Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
- Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356 (2014).
- Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
- Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
- Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503 (2021).
- Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
- Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
- Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604 (2016).
- Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
- Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
- Ge, L., Shin, W., Wu, L. -. G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
- Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351 (2012).
- Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
- Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
- Thahouly, T., Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. 2233, (2021).
- Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
- O’Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
- Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
- Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
- Gao, J., Liao, J., Yang, G. -. Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , 18 (2009).
- Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478 (2021).
