Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

Celkweektechnieken hebben geleid tot tal van vooruitgang op verschillende gebieden van cellulaire neurofysiologie in gezondheid en ziekte. Met name primaire celculturen, vers geïsoleerd uit het neuronale weefsel van een proefdier, stellen de experimentator in staat om het gedrag van diverse cellen in verschillende biochemische media en fysiologische opstellingen nauwkeurig te bestuderen. Het gebruik van verschillende fluorescerende fysiologische indicatoren zoals de Ca²⁺-gevoelige kleurstoffen in combinatie met time-lapse videomicroscopie geeft in real time beter inzicht in de cellulaire biofysische en biochemische processen.

ALS is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die de bovenste en onderste motorneuronen^{aantast 1}. De ziekte heeft een complexe pathogenese van het familiale type, maar meestal van de sporadische vorm (90% van de gevallen)². Het is bekend dat niet-cel autonome mechanismen bijdragen aan de PATHOFYSIOLOGIE VAN ALS, voornamelijk vanwege de essentiële rol van gliacellen³. ALS wordt ook goed gekarakteriseerd als een neuro-inflammatoire ziekte met betrokkenheid van humorale en cellulaire ontstekingsfactoren.

Immunoglobuline G wordt veel gebruikt als moleculaire marker bij ALS en andere neurodegeneratieve ziekten. Het bestuderen van het serumniveau van deze marker kan wijzen op de aanwezigheid en het stadium van neuro-inflammatie bij de ziekte ^4,5,6, terwijl de aanwezigheid ervan in het hersenvocht kan wijzen op een doorbraak van de bloed-hersenbarrière⁷. IKG’s werden ook geïdentificeerd als afzettingen in de motorneuronen van het ruggenmerg van ALS-patiënten⁷. Niettemin heeft deze benadering enkele inconsistenties aangetoond in de correlatie van het niveau van IgG’s met het stadium en de kenmerken van de ziekte⁶.

IgG geïsoleerd uit de sera van ALS-patiënten (ALS IgG) kan een calciumrespons induceren in naïeve astrocyten⁸ en glutamaatafgifte in neuronen, wat wijst op een excitotoxisch effect – een kenmerk van ALS-pathologie⁹. Studies naar het hSOD1^G93A ALS-rattenmodel (met meerdere kopieën van de menselijke SOD1-mutatie¹⁰) toonden echter een aantal markers van oxidatieve stress in gekweekte neurogliale cellen¹¹, weefsels 12,13,14 of levende dieren ¹³. Het is opmerkelijk dat de astrocyten gekweekt uit het ALS-rattenmodel meer vatbaar waren voor oxidatieve stress veroorzaakt door peroxide dan de astroglia van niet-transgene nestgenoten¹¹.

Microgliale cellen in cultuur worden op een minder duidelijke manier beïnvloed door ALS IgG. Een BV-2 microgliale cellijn vertoonde namelijk een stijging van het signaal van fluorescerende markers van oxidatieve stress als reactie op de toepassing van slechts 4/11 ALS IgG-patiëntenmonsters¹⁵. Het is bekend dat microglia deelnemen aan vele neuro-inflammatoire pathologieën, wat bijdraagt aan oxidatieve stress en late progressiefase in het niet-cel autonome mechanisme van ALS ^16,17. Niettemin gaven de gegevens met ALS IgG’s aan dat deze cellen mogelijk niet zo reactief zijn als astrocyten op deze humorale factoren van ALS-ontsteking. Er zijn verschillende studies uitgevoerd met primaire astrocyten van ALS-muizenmodellen, niet alleen bij pups maar ook bij symptomatische dieren, hetzij op de hersenen of op het ruggenmerg 18,19,20,21. Dit geldt ook voor microgliale primaire culturen, hoewel in mindere mate dan astrocyten en meestal uit hersengebieden in het embryonale stadium 22,23,24.

We gebruiken time-lapse video beeldvorming van Ca²⁺ op cellen in cultuur voornamelijk als een middel om intracellulaire transiënten van dit ion te volgen als een fysiologische marker van excitotoxiciteit. Dus door biofysische karakterisering van deze transiënten (amplitude, gebied onder transiënt, rise-time, frequentie) kan de onderzoeker experimentele diagnostische parameters verkrijgen uit verschillende cellulaire modellen van neurodegeneratie. Deze techniek biedt dus een voordeel van een kwantitatieve fysiologische beoordeling van IKG’s als ziektebiomarkers. Er is een grote hoeveelheid literatuur over de rol van IgG’s en Ca²⁺ bij de inductie van ALS. De meeste van deze studies werden uitgevoerd door ALS te induceren door patiënt IgG’s in proefdieren^te injecteren 25,26,27,28,29, die vervolgens intracellulaire Ca²⁺ verhoging en IgG-afzettingen vertoonden. Een reeks studies onderzocht het effect van ALS IKG’s op de motorische synaps in vitro 30,31,32. In de bovenstaande context legt de hier gepresenteerde techniek de focus op de gliacellen als belangrijke spelers in het niet-cel autonome mechanisme van ALS en kwantificeert hun potentiële excitotoxische reactie op IgG’s als humorale factoren van neuro-inflammatie. Deze aanpak kan een bredere toepassing hebben bij het testen van andere humorale factoren zoals hele sera, CSF of cytokines in verschillende celkweeksystemen en in cellulaire modellen van algemene ontsteking.

Dit artikel beschrijft hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen verder kunnen worden gebruikt om ALS-pathofysiologie te bestuderen met van sera afgeleide IgG van patiënten. Protocollen zijn gedetailleerd voor het laden van kleurstof van gekweekte cellen (figuur 1) en de opnames van Ca²⁺ veranderingen in time-lapse videobeeldvormingsexperimenten. Voorbeelden van video-opnames zullen laten zien hoe gliacellen reageren op ALS IgG in vergelijking met ATP, waarbij de laatste purinerge membraanreceptoren activeert. Voor het eerst wordt een voorbeeld getoond over hoe astrocyten geïsoleerd uit de hSOD1^G93A ALS-rattenhersenen reageren met een meer uitgesproken Ca²⁺ respons op ALS IgG in vergelijking met niet-transgene controles en hoe dit proces te relateren aan de verschillen in Ca²⁺ winkelwerking. Ook is een voorbeeld getoond van calciumbeeldvorming in microgliale cellen die acuut worden uitgedaagd met ALS IgG, met slechts een bescheiden respons van intracellulair calcium.