Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

Les techniques de culture cellulaire ont donné lieu à de nombreux progrès dans divers domaines de la neurophysiologie cellulaire dans la santé et la maladie. En particulier, les cultures de cellules primaires, fraîchement isolées du tissu neuronal d’un animal de laboratoire, permettent à l’expérimentateur d’étudier de près le comportement de diverses cellules dans différents milieux biochimiques et configurations physiologiques. L’utilisation de différents indicateurs physiologiques fluorescents tels que les colorants sensibles au Ca²⁺ en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse permet de mieux comprendre les processus biophysiques et biochimiques cellulaires en temps réel.

La SLA est une maladie neurodégénérative dévastatrice qui affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs¹. La maladie présente une pathogenèse complexe de type familial mais surtout de forme sporadique (90% des cas)². Il est bien connu que les mécanismes autonomes non cellulaires contribuent à la physiopathologie de la SLA, principalement en raison du rôle essentiel des cellules gliales³. La SLA est également bien caractérisée comme une maladie neuroinflammatoire avec implication de facteurs humoraux et cellulaires de l’inflammation.

L’immunoglobuline G est largement utilisée comme marqueur moléculaire de la SLA et d’autres maladies neurodégénératives. L’étude du taux sérique de ce marqueur peut indiquer la présence et le stade de la neuroinflammation dans la maladie ^4,5,6, tandis que sa présence dans le liquide céphalorachidien peut indiquer une brèche de la barrière hémato-encéphalique⁷. Les IgG ont également été identifiées comme des dépôts dans les motoneurones de la moelle épinière de patients atteints de SLA⁷. Néanmoins, cette approche a montré quelques incohérences dans la corrélation du taux d’IgG avec le stade et les caractéristiques de la maladie⁶.

Les IgG isolées à partir des sérums de patients atteints de SLA (IgG SLA) peuvent induire une réponse calcique dans les astrocytes^{naïfs 8} et la libération de glutamate dans les neurones, ce qui indique un effet excitotoxique – une caractéristique de la pathologie de la SLA⁹. Cependant, des études sur le modèle de rat hSOD1^G93A ALS (contenant plusieurs copies de la mutation humaine SOD1¹⁰) ont montré un certain nombre de marqueurs du stress oxydatif dans les cellules neurogliales en culture¹¹, les tissus 12,13,14 ou les animaux vivants ¹³. Il est à noter que les astrocytes cultivés à partir du modèle de rat SLA étaient plus sujets au stress oxydatif induit par le peroxyde que les astroglies de compagnons de portée non transgéniques¹¹.

Les cellules microgliales en culture sont affectées par les IgG de la SLA d’une manière moins apparente. À savoir, une lignée cellulaire microgliale BV-2 a montré une augmentation du signal provenant de marqueurs fluorescents du stress oxydatif en réponse à l’application de seulement 4/11 échantillons de patients atteints d’IgG SLA¹⁵. Il est bien connu que la microglie participe à de nombreuses pathologies neuroinflammatoires, ajoutant au stress oxydatif et à la phase de progression tardive dans le mécanisme autonome non cellulaire de la SLA^16,17. Néanmoins, les données avec les IgG de la SLA ont indiqué que ces cellules peuvent ne pas être aussi réactives que les astrocytes à ces facteurs humoraux de l’inflammation de la SLA. Plusieurs études ont été menées avec des astrocytes primaires à partir de modèles murins de SLA, non seulement chez les petits mais aussi chez les animaux symptomatiques, soit sur le cerveau, soit sur la moelle épinière 18,19,20,21. Cela est également vrai pour les cultures primaires microgliales, bien que dans une moindre mesure que les astrocytes et principalement à partir de régions du cerveau au stade embryonnaire^22,23,24.

Nous utilisons l’imagerie vidéo accélérée de Ca²⁺ sur des cellules en culture principalement comme moyen de suivre les transitoires intracellulaires de cet ion en tant que marqueur physiologique de l’excitotoxicité. Ainsi, par la caractérisation biophysique de ces transitoires (amplitude, aire sous transitoire, temps de montée, fréquence) le chercheur peut obtenir des paramètres diagnostiques expérimentaux à partir de divers modèles cellulaires de neurodégénérescence. Cette technique offre donc l’avantage d’une évaluation physiologique quantitative des IgG en tant que biomarqueurs de la maladie. Il existe une abondante littérature sur le rôle des IgG et du Ca²⁺ dans l’induction de la SLA. La plupart de ces études ont été réalisées en induisant la SLA en injectant des IgG à des patients 25,26,27,28,29^, qui ont ensuite montré une élévation intracellulaire du Ca ²⁺ et des dépôts d’IgG. Une série d’études a exploré l’effet des IgG de la SLA sur la synapse motrice in vitro^30,31,32. Dans le contexte ci-dessus, la technique présentée ici met l’accent sur les cellules gliales en tant qu’acteurs importants du mécanisme autonome non cellulaire de la SLA et quantifie leur réponse excitotoxique potentielle aux IgG en tant que facteurs humoraux de la neuroinflammation. Cette approche peut avoir une application plus large dans le test d’autres facteurs humoraux tels que les sérums entiers, le LCR ou les cytokines dans différents systèmes de culture cellulaire et dans des modèles cellulaires d’inflammation générale.

Cet article décrit comment préparer des cultures primaires de cellules gliales, d’astrocytes et de microglies à partir des cortex de rats Sprague Dawley et comment utiliser davantage ces cellules pour étudier la physiopathologie de la SLA avec des IgG dérivées de sérums de patients. Les protocoles sont détaillés pour le chargement de colorant des cellules en culture (Figure 1) et les enregistrements des changements de Ca²⁺ dans les expériences d’imagerie vidéo accélérée. Des exemples d’enregistrements vidéo montreront comment les cellules gliales réagissent aux IgG de la SLA par rapport à l’ATP, ce dernier activant les récepteurs de la membrane purinergique. Pour la première fois, on montre un exemple sur la façon dont les astrocytes isolés du cerveau de rat hSOD1^G93A de la SLA réagissent avec une réponse Ca 2+ plus prononcée aux IgG de la SLA par rapport aux témoins non transgéniques et comment relier ce processus aux différences dans le fonctionnement du magasin Ca²⁺. On montre également un exemple d’imagerie calcique dans les cellules microgliales fortement défiées par les IgG SLA, avec seulement une réponse modeste du calcium intracellulaire.