Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Le tecniche di coltura cellulare hanno dato origine a numerosi progressi in diversi campi della neurofisiologia cellulare in salute e malattia. In particolare, le colture cellulari primarie, appena isolate dal tessuto neuronale di un animale da laboratorio, consentono allo sperimentatore di studiare da vicino il comportamento di diverse cellule in diversi mezzi biochimici e configurazioni fisiologiche. L’utilizzo di diversi indicatori fisiologici fluorescenti come i coloranti sensibili al Ca²⁺ in combinazione con la microscopia video time-lapse fornisce una migliore comprensione dei processi biofisici e biochimici cellulari in tempo reale.

La SLA è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce i motoneuroni superiori e inferiori¹. La malattia presenta una patogenesi complessa di tipo familiare ma soprattutto della forma sporadica (90% dei casi)². È noto che i meccanismi autonomi non cellulari contribuiscono alla fisiopatologia della SLA, principalmente a causa del ruolo essenziale delle cellule gliali³. La SLA è anche ben caratterizzata come una malattia neuroinfiammatoria con coinvolgimento di fattori umorali e cellulari di infiammazione.

L’immunoglobulina G è ampiamente usata come marcatore molecolare nella SLA e in altre malattie neurodegenerative. Studiare il livello sierico di questo marcatore può indicare la presenza e lo stadio della neuroinfiammazione nella malattia ^4,5,6, mentre la sua presenza nel liquido cerebrospinale può indicare una rottura della barriera ematoencefalica⁷. Le IgG sono state anche identificate come depositi nei motoneuroni del midollo spinale dei pazienti con SLA⁷. Tuttavia, questo approccio ha mostrato alcune incongruenze nella correlazione del livello di IgG con lo stadio e le caratteristiche della malattia⁶.

Le IgG isolate dai sieri dei pazienti affetti da SLA (SLA IgG) possono indurre una risposta al calcio negli astrociti naïve⁸ e il rilascio di glutammato nei neuroni, indicando un effetto eccitotossico, un segno distintivo della patologia della SLA⁹. Tuttavia, gli studi sul modello di ratto hSOD1^G93A ALS (contenente copie multiple della mutazione umana SOD1¹⁰) hanno mostrato un numero di marcatori di stress ossidativo in cellule neurogliali in coltura¹¹, tessuti 12,13,14 o animali vivi ¹³. È interessante notare che gli astrociti coltivati dal modello di ratto SLA erano più inclini allo stress ossidativo indotto dal perossido rispetto agli astroglia dei compagni di cucciolata non transgenici¹¹.

Le cellule microgliali in coltura sono influenzate dalla SLA IgG in modo meno evidente. Vale a dire, una linea cellulare microgliale BV-2 ha mostrato un aumento del segnale dai marcatori fluorescenti dello stress ossidativo in risposta all’applicazione di soli 4/11 campioni di pazienti IgG ALS¹⁵. È noto che le microglia partecipano a molte patologie neuroinfiammatorie, aggiungendo stress ossidativo e fase di progressione tardiva nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA^16,17. Tuttavia, i dati con le IgG della SLA hanno indicato che queste cellule potrebbero non essere reattive come gli astrociti a questi fattori umorali dell’infiammazione della SLA. Diversi studi sono stati condotti con astrociti primari da modelli murini di SLA, non solo nei cuccioli ma anche in animali sintomatici, sia sul cervello che sul midollo spinale 18,19,20,21. Questo vale anche per le colture primarie microgliali, anche se in misura minore rispetto agli astrociti e per lo più dalle regioni del cervello allo stadio embrionale^22,23,24.

Usiamo l’imaging video time-lapse di Ca²⁺ su cellule in coltura principalmente come mezzo per seguire i transitori intracellulari di questo ione come marker fisiologico di eccitotossicità. Pertanto, mediante la caratterizzazione biofisica di questi transitori (ampiezza, area sotto transitoria, tempo di salita, frequenza) il ricercatore può ottenere parametri diagnostici sperimentali da diversi modelli cellulari di neurodegenerazione. Questa tecnica offre quindi il vantaggio di una valutazione fisiologica quantitativa delle IgG come biomarcatori della malattia. Esiste un ampio corpus di letteratura sul ruolo delle IgG e del Ca²⁺ nell’induzione della SLA. La maggior parte di questi studi sono stati condotti inducendo la SLA iniettando IgG del paziente in animali da esperimento 25,26,27,28,29^, che hanno poi mostrato elevazione intracellulare di Ca ²⁺ e deposizioni di IgG. Una linea di studi ha esplorato l’effetto delle IgG di SLA sulla sinapsi motoria in vitro^30,31,32. Nel contesto di cui sopra, la tecnica qui presentata pone l’attenzione sulle cellule gliali come attori importanti nel meccanismo autonomo non cellulare della SLA e quantifica la loro potenziale risposta eccitotossica alle IgG come fattori umorali della neuroinfiammazione. Questo approccio può avere un’applicazione più ampia nel testare altri fattori umorali come sieri interi, liquori o citochine in diversi sistemi di coltura cellulare e in modelli cellulari di infiammazione generale.

Questo articolo descrive come preparare colture primarie di cellule gliali, astrociti e microglia dalle cortecce dei ratti Sprague Dawley e come utilizzare ulteriormente queste cellule per studiare la fisiopatologia della SLA con IgG derivate dai sieri dei pazienti. I protocolli sono dettagliati per il caricamento del colorante delle cellule in coltura (Figura 1) e le registrazioni dei cambiamenti di Ca²⁺ negli esperimenti di imaging video time-lapse. Esempi di registrazioni video mostreranno come le cellule gliali reagiscono alle IgG della SLA rispetto all’ATP, quest’ultimo attivando i recettori purinergici della membrana. Viene mostrato per la prima volta un esempio di come gli astrociti isolati dal cervello del ratto hSOD1^G93A ALS reagiscono con una risposta Ca 2+ più pronunciata alle IgG di SLA rispetto ai controlli non transgenici e come correlare questo processo alle differenze nel funzionamento del negozio Ca²⁺. Viene anche mostrato un esempio di imaging del calcio nelle cellule microgliali acutamente sfidate con SLA IgG, con solo una modesta risposta di calcio intracellulare.