Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

As técnicas de cultura de células deram origem a inúmeros avanços em diversos campos da neurofisiologia celular na saúde e na doença. Particularmente, as culturas de células primárias, recém-isoladas do tecido neuronal de um animal de laboratório, permitem que o experimentador estude de perto o comportamento de diversas células em diferentes meios bioquímicos e configurações fisiológicas. O uso de diferentes indicadores fisiológicos fluorescentes, como os corantes sensíveis ao Ca^2+, em combinação com a microscopia de vídeo de lapso de tempo, fornece uma melhor visão dos processos biofísicos e bioquímicos celulares em tempo real.

A ELA é uma doença neurodegenerativa devastadora que afeta os neurônios motores superiores e inferiores¹. A doença tem uma patogênese complexa do tipo familiar, mas principalmente da forma esporádica (90% dos casos)². Sabe-se que mecanismos autônomos não celulares contribuem para a fisiopatologia da ELA, principalmente devido ao papel essencial das células gliais³. A ELA também é bem caracterizada como uma doença neuroinflamatória com envolvimento de fatores humorais e celulares de inflamação.

A imunoglobulina G é amplamente utilizada como marcador molecular na ELA e em outras doenças neurodegenerativas. Estudar o nível sérico desse marcador pode indicar a presença e o estágio da neuroinflamação na doença ^4,5,6, enquanto sua presença no líquido cefalorraquidiano pode indicar uma violação da barreira hematoencefálica 7. IgGs também foram identificadas como depósitos nos neurônios motores da medula espinhal de pacientes com ELA⁷. No entanto, essa abordagem tem mostrado algumas inconsistências na correlação do nível de IgGs com o estágio e as características da doença⁶.

A IgG isolada dos soros de pacientes com ELA (ALS IgG) pode induzir uma resposta de cálcio em astrócitos ingênuos⁸ e liberação de glutamato em neurônios, apontando para um efeito excitotóxico – uma característica da patologia da ELA⁹. No entanto, estudos sobre o modelo de camundongo HSA hSOD1^G93A (contendo múltiplas cópias da mutação humana^{SOD1 10}) mostraram uma série de marcadores de estresse oxidativo em células neurogliais cultivadas 11, tecidos 12,13,14 ou animais vivos ¹³. Ressalta-se que os astrócitos cultivados a partir do modelo de ratos com ELA foram mais propensos ao estresse oxidativo induzido pelo peróxido do que a astroglia de companheiros de ninhada não transgênicos¹¹.

As células microgliais em cultura são afetadas pela ELA IgG de forma menos aparente. Ou seja, uma linhagem celular microglial BV-2 apresentou um aumento no sinal de marcadores fluorescentes de estresse oxidativo em resposta à aplicação de apenas 4/11 amostras de pacientes com ELA IgG¹⁵. Sabe-se que a micróglia participa de muitas patologias neuroinflamatórias, aumentando o estresse oxidativo e a fase de progressão tardia no mecanismo autônomo não celular da ELA^16,17. No entanto, os dados com IgGs da ELA indicaram que essas células podem não ser tão reativas quanto os astrócitos a esses fatores humorais da inflamação da ELA. Vários estudos têm sido realizados com astrócitos primários de modelos murinos de ELA, não apenas em filhotes, mas também em animais sintomáticos, seja no cérebro ou na medula espinhal 18,19,20,21. Isso também é verdade para culturas primárias microgliais, embora em menor grau do que os astrócitos e principalmente de regiões cerebrais no estágio embrionário^22,23,24.

Usamos imagens de vídeo de lapso de tempo de Ca²⁺ em células em cultura principalmente como um meio de seguir os transientes intracelulares deste íon como um marcador fisiológico de excitotoxicidade. Assim, pela caracterização biofísica desses transientes (amplitude, área sob transiente, tempo de subida, frequência) o pesquisador pode obter parâmetros diagnósticos experimentais a partir de diversos modelos celulares de neurodegeneração. Esta técnica oferece, portanto, uma vantagem de uma avaliação fisiológica quantitativa de IgGs como biomarcadores da doença. Há um grande corpo de literatura sobre o papel das IgGs e Ca²⁺ na indução da ELA. A maioria desses estudos foi realizada induzindo ELA injetando IgGs de pacientes em animais experimentais 25,26,27,28,29^, que então mostraram elevação intracelular de Ca ²⁺ e deposições de IgG. Uma linha de estudos explorou o efeito da ELA IgGs na sinapse motora in vitro^30,31,32. No contexto acima, a técnica aqui apresentada coloca o foco nas células gliais como atores importantes no mecanismo autônomo não celular da ELA e quantifica sua potencial resposta excitotóxica às IgGs como fatores humorais da neuroinflamação. Essa abordagem pode ter uma aplicação mais ampla no teste de outros fatores humorais como soros inteiros, LCR ou citocinas em diferentes sistemas de cultura celular e em modelos celulares de inflamação geral.

Este artigo descreve como preparar culturas primárias de células gliais, astrócitos e micróglia a partir dos córtices de ratos Sprague Dawley e como usar essas células para estudar a fisiopatologia da ELA com IgG derivada de soros de pacientes. Os protocolos são detalhados para o carregamento de corante de células cultivadas (Figura 1) e as gravações de alterações de Ca²⁺ em experimentos de imagem de vídeo de lapso de tempo. Exemplos de gravações de vídeo mostrarão como as células gliais reagem à ALS IgG em comparação com o ATP, este último ativando os receptores de membrana purinérgicos. Mostrado pela primeira vez é um exemplo de como os astrócitos isolados do cérebro de ratos hSOD1^G93A ALS reagem com uma resposta mais pronunciada de Ca 2+ à ALS IgG em comparação com controles não transgênicos e como relacionar esse processo com as diferenças na operação de armazenamento de Ca²⁺. Também é mostrado um exemplo de imagem de cálcio em células microgliais agudamente desafiadas com ALS IgG, com apenas uma resposta modesta de cálcio intracelular.