Первичные культуры астроцитов и микроглии крыс и их использование в изучении бокового амиотрофического склероза

Методы культивирования клеток привели к многочисленным достижениям в различных областях клеточной нейрофизиологии в области здравоохранения и болезней. В частности, первичные клеточные культуры, недавно выделенные из нейронной ткани лабораторного животного, позволяют экспериментатору внимательно изучать поведение различных клеток в различных биохимических средах и физиологических установках. Использование различных флуоресцентных физиологических показателей, таких как чувствительные красители Ca²⁺, в сочетании с покадровой видеомикроскопией обеспечивает лучшее понимание клеточных биофизических и биохимических процессов в режиме реального времени.

БАС является разрушительным нейродегенеративным заболеванием, которое поражает верхние и нижние двигательные нейроны¹. Заболевание имеет сложный патогенез семейного типа, но преимущественно спорадической формы (90% случаев)². Хорошо известно, что неклеточные автономные механизмы способствуют патофизиологии БАС, в первую очередь из-за существенной роли глиальных клеток³. БАС также хорошо характеризуется как нейровоспалительное заболевание с участием гуморальных и клеточных факторов воспаления.

Иммуноглобулин G широко используется в качестве молекулярного маркера при БАС и других нейродегенеративных заболеваниях. Изучение сывороточного уровня этого маркера может свидетельствовать о наличии и стадии нейровоспаления при заболевании ^4,5,6, в то время как его наличие в спинномозговой жидкости может свидетельствовать о нарушении гематоэнцефалического барьера⁷. IgGs также были идентифицированы как отложения в двигательных нейронах спинного мозга пациентов с БАС⁷. Тем не менее, данный подход показал некоторые несоответствия в соотношении уровня IgGs со стадией и особенностями заболевания⁶.

IgG, выделенный из сывороток пациентов с БАС (ALS IgG), может индуцировать кальциевый ответ в наивных астроцитах⁸ и высвобождение глутамата в нейронах, указывая на экситотоксический эффект – отличительный признак патологии БАС⁹. Однако исследования на крысиной модели hSOD1^G93A ALS (содержащей множественные копии человеческой мутации SOD1¹⁰) показали ряд маркеров окислительного стресса в культивируемых нейроглиальных клетках¹¹, тканях 12,13,14 или живых животных ¹³. Примечательно, что астроциты, культивируемые из модели крыс с БАС, были более склонны к окислительному стрессу, вызванному перекисью, чем астроглия у нетрансгенных пометников¹¹.

Клетки микроглии в культуре подвергаются воздействию ALS IgG менее очевидным образом. А именно, линия микроглиальных клеток BV-2 показала повышение сигнала от флуоресцентных маркеров окислительного стресса в ответ на применение только 4/11 ALS IgG образцов пациента¹⁵. Хорошо известно, что микроглии участвуют во многих нейровоспалительных патологиях, добавляя к окислительному стрессу и поздней фазе прогрессирования в неклеточном автономном механизме БАС^16,17. Тем не менее, данные с ALS IgGs показали, что эти клетки могут быть не такими реактивными, как астроциты, на эти гуморальные факторы воспаления БАС. Было проведено несколько исследований с первичными астроцитами из мышиных моделей БАС не только у детенышей, но и у симптоматических животных, либо на головном, либо на спинном мозге 18,19,20,21. Это также верно для первичных культур микроглии, хотя и в меньшей степени, чем астроциты и в основном из областей мозга на эмбриональной стадии 22,23,24.

Мы используем покадровую видеовизуализацию Ca²⁺ на клетках в культуре в первую очередь как средство для отслеживания внутриклеточных переходных процессов этого иона в качестве физиологического маркера экситотоксичности. Таким образом, путем биофизической характеристики этих переходных процессов (амплитуда, площадь под переходным процессом, время нарастания, частота) исследователь может получить экспериментальные диагностические параметры из различных клеточных моделей нейродегенерации. Таким образом, этот метод дает преимущество количественной физиологической оценки IgGs как биомаркеров заболевания. Существует большое количество литературы о роли IgGs и Ca²⁺ в индукции БАС. Большинство из этих исследований были выполнены путем индуцирования БАС путем введения пациенту IgGs экспериментальным животным 25,26,27,28,29, которые затем показали внутриклеточное повышение Ca²⁺ и IgG. В ряде исследований изучалось влияние ALS IgGs на моторный синапс in vitro 30,31,32. В приведенном выше контексте метод, представленный здесь, фокусируется на глиальных клетках как важных игроках в неклеточном автономном механизме БАС и количественно оценивает их потенциальный экситотоксический ответ на IgGs как гуморальные факторы нейровоспаления. Этот подход может иметь более широкое применение при тестировании других гуморальных факторов, таких как целые сыворотки, ликвор или цитокины в различных системах клеточных культур и в клеточных моделях общего воспаления.

В этой статье описывается, как подготовить первичные культуры глиальных клеток, астроцитов и микроглии из коры крыс Sprague Dawley и как в дальнейшем использовать эти клетки для изучения патофизиологии БАС с помощью IgG, полученного из сыворотки пациента. Протоколы подробно описаны для загрузки красителем культивируемых клеток (рисунок 1) и записей изменений Ca²⁺ в экспериментах с покадровой видеоизображением. Примеры видеозаписей покажут, как глиальные клетки реагируют на ALS IgG по сравнению с АТФ, последний активирует пуринергические мембранные рецепторы. Впервые показан пример того, как астроциты, выделенные из мозга крысы hSOD1^{G93A ALS} , реагируют с более выраженным ответом Ca²⁺ на ALS IgG по сравнению с нетрансгенным контролем и как связать этот процесс с различиями в работе магазина Ca²⁺ . Также показан пример визуализации кальция в клетках микроглии, остро оспариваемых ALS IgG, с лишь скромным ответом внутриклеточного кальция.