Summary

Célula única reutilizable para análisis epigenómicos iterativos

Published: February 11, 2022
doi:

Summary

El presente protocolo describe un método de una sola célula para análisis epigenómicos iterativos utilizando una sola célula reutilizable. La célula única reutilizable permite el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula única y la validación estadística de los resultados.

Abstract

Los análisis actuales del epigenoma unicelular están diseñados para un solo uso. La célula se descarta después de un solo uso, evitando el análisis de múltiples marcas epigenéticas en una sola célula y requiriendo datos de otras células para distinguir la señal del ruido de fondo experimental en una sola célula. Este artículo describe un método para reutilizar la misma célula individual para análisis epigenómicos iterativos.

En este método experimental, las proteínas celulares se anclan primero a un polímero de poliacrilamida en lugar de entrecruzarlas a proteínas y ADN, aliviando el sesgo estructural. Este paso crítico permite repetir experimentos con la misma célula. A continuación, un cebador aleatorio con una secuencia de andamio para la ligadura de proximidad se recoce al ADN genómico, y la secuencia genómica se agrega al cebador por extensión utilizando una ADN polimerasa. Posteriormente, un anticuerpo contra un marcador epigenético y control IgG, cada uno marcado con diferentes sondas de ADN, se unen a los respectivos objetivos en la misma célula individual.

La ligadura de proximidad se induce entre el cebador aleatorio y el anticuerpo mediante la adición de un ADN conector con secuencias complementarias a la secuencia de andamio del cebador aleatorio y la sonda de anticuerpo-ADN. Este enfoque integra información de anticuerpos y secuencias genómicas cercanas en un solo producto de ADN de ligadura de proximidad. Al permitir experimentos repetidos con la misma célula única, este método permite un aumento en la densidad de datos de una célula rara y un análisis estadístico utilizando solo datos de IgG y anticuerpos de la misma célula. Las células individuales reutilizables preparadas por este método pueden almacenarse durante al menos unos meses y reutilizarse más tarde para ampliar la caracterización epigenética y aumentar la densidad de datos. Este método proporciona flexibilidad a los investigadores y sus proyectos.

Introduction

La tecnología unicelular está entrando en la era de la multiómica unicelular, que integra tecnologías ómicas unicelulares individuales1. Recientemente, la transcriptómica unicelular se ha combinado con métodos para detectar la accesibilidad a la cromatina (scNMT-seq2 y SHARE-seq3) o modificaciones de histonas (Paired-seq4 y Paired-Tag5). Más recientemente, la transcriptómica y la proteómica unicelular se integraron con la accesibilidad a la cromatina (DOGMA-seq6). Estos métodos utilizan el etiquetado basado en transposasa para detectar la accesibilidad de la cromatina o las modificaciones de histonas.

Los enfoques basados en transposasa escinden el ADN genómico y agregan un código de barras de ADN al final del fragmento de ADN genómico. Cada fragmento genómico escindido solo puede aceptar hasta dos códigos de barras de ADN (= una marca epigenética por sitio de escisión), y el ADN genómico en el sitio de escisión se pierde. Por lo tanto, los enfoques basados en la escisión tienen una compensación entre el número de marcas epigenéticas probadas y la densidad de la señal. Esto dificulta el análisis de múltiples marcas epigenéticas en la misma célula. Para superar este problemase desarrolló un método epigenómico unicelular que no escinde el ADN genómico 7,8.

Además del problema derivado de la escisión mencionado anteriormente, los enfoques basados en la transposasa tienen otras limitaciones. En el análisis del epigenoma unicelular, es fundamental conocer la ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al ADN en el genoma. En los enfoques actuales, esto se logra mediante el uso de células individuales no fijadas y la retención de interacciones proteína-ADN y proteína-proteína. Sin embargo, esto genera un fuerte sesgo a las regiones de cromatina accesibles, incluso en el análisis de modificaciones de histonas 9. La ubicación de las histonas y las proteínas asociadas al genoma en el genoma se puede preservar sin reticulación proteína-ADN y proteína-proteína, utilizando un andamio de poliacrilamida 7,8. Este enfoque reduce el sesgo estructural observado en los enfoques actuales que dependen de las interacciones proteína-ADN y proteína-proteína.

Los enfoques basados en transposasa pueden adquirir señales solo una vez de una sola célula. Por lo tanto, es difícil delinear el epigenoma completo de una sola célula debido a la caída de las señales. Las células individuales reutilizables se han desarrollado para superar las limitaciones actuales al permitir el análisis epigenómico iterativo en la misma célula individual.

Protocol

NOTA: En la figura 1 se muestra una representación esquemática del método. Figura 1: Representación esquemática del flujo de trabajo del protocolo. Los pasos 7.2-13 se explican a través de representaciones esquemáticas. Cada fila indica un paso en el protocolo. Una proteína celular coloreada …

Representative Results

Las celdas individuales K562 se generaron utilizando el protocolo descrito en el paso 8 (consulte la figura 5). Las células individuales se incrustaron en la capa externa de la perla de poliacrilamida. El ADN celular se tiñó y visualizó utilizando un tinte intercalador para la tinción del ADN. Figura 5: C?…

Discussion

Este artículo describe el protocolo paso a paso para el análisis multiepigenómico unicelular recientemente reportado utilizando células individuales reutilizables7. En los párrafos siguientes, discutimos puntos críticos, enfatizando las posibles limitaciones en el protocolo.

Uno de los puntos críticos a lo largo del protocolo (de los pasos 7.2-13) es evitar la contaminación por DNasa. Una sola célula solo tiene dos copias de ADN genómico. Por lo tanto, el ADN…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los doctores David Sánchez-Martin y Christopher B. Buck por sus comentarios durante la etapa de conceptualización del proyecto. También agradecemos al Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health por su ayuda en experimentos preliminares, y al Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH por su asesoramiento en análisis computacional. Anna Word por ayudar con la optimización de las ADN polimerasas utilizadas en el método. Este trabajo utilizó los recursos computacionales del clúster Biowulf (http://hpc.nih.gov) de NIHHPC. Este proyecto es apoyado por el Programa Intramuros del Centro de Investigación del Cáncer, el Instituto Nacional del Cáncer, los Institutos Nacionales de Salud, el Premio a la Innovación del Director del NCI (#397172) y fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer bajo el Contrato No. HHSN261200800001E. Agradecemos a los doctores Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy y a todos los miembros del Laboratorio de Oncología Celular por sus comentarios productivos.

Materials

10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

References

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Cite This Article
Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

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