Summary

反復エピゲノム解析のための再利用可能な単一細胞

Published: February 11, 2022
doi:

Summary

本プロトコルは、再利用可能な単一細胞を用いた反復エピゲノム解析のための単一細胞法を記載する。再利用可能なシングルセルにより、同じシングルセル内の複数のエピジェネティックマークの分析と結果の統計的検証が可能になります。

Abstract

現在のシングルセルエピゲノム解析は、シングルユース向けに設計されています。細胞は1回の使用で廃棄されるため、単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析が妨げられ、単一細胞内の実験的バックグラウンドノイズからシグナルを区別するために他の細胞からのデータが必要になります。この論文では、反復的なエピゲノム解析のために同じ単一細胞を再利用する方法について説明します。

この実験方法では、細胞タンパク質をタンパク質やDNAに架橋するのではなく、まずポリアクリルアミドポリマーに固定し、構造バイアスを軽減します。この重要なステップにより、同じ単一細胞で繰り返し実験を行うことができます。次に、近接ライゲーション用のスキャフォールド配列を有するランダムプライマーをゲノムDNAにアニーリングし、DNAポリメラーゼを用いて伸長によりゲノム配列をプライマーに付加する。続いて、それぞれ異なるDNAプローブで標識されたエピジェネティックマーカーおよびコントロールIgGに対する抗体を、同じ単一細胞内のそれぞれの標的に結合させる。

ランダムプライマーと抗体-DNAプローブの足場配列に相補配列を有するコネクターDNAを付加することにより、ランダムプライマーと抗体との間の近接ライゲーションが誘導される。このアプローチは、抗体情報と近くのゲノム配列を近接ライゲーションの単一のDNA産物に統合します。同じ単一細胞で実験を繰り返すことで、希少細胞からのデータ密度を高め、同一細胞のIgGと抗体データのみを用いた統計解析を可能にします。この方法で調製された再利用可能な単一細胞は、少なくとも数ヶ月間保存し、後で再利用してエピジェネティックな特性評価を広げ、データ密度を高めることができます。この方法は、研究者とそのプロジェクトに柔軟性を提供します。

Introduction

シングルセル技術は、個々のシングルセルオミクス技術を統合したシングルセルマルチオミクスの時代に突入しています1。最近、シングルセルトランスクリプトミクスは、クロマチンアクセシビリティ(scNMT-seq2 およびSHARE-seq 3)またはヒストン修飾(ペア-seq4 およびペアタグ5)を検出するための方法と組み合わせています。最近では、シングルセルトランスクリプトミクスとプロテオミクスがクロマチンアクセシビリティと統合されました(DOGMA-seq6)。これらの方法は、クロマチンアクセシビリティまたはヒストン修飾を検出するためにトランスポザーゼベースのタグ付けを使用します。

トランスポザーゼベースのアプローチは、ゲノムDNAを切断し、ゲノムDNA断片の最後にDNAバーコードを追加します。切断された各ゲノム断片は、最大2つのDNAバーコード(=切断部位ごとに1つのエピジェネティックマーク)しか受け入れることができず、切断部位のゲノムDNAは失われます。したがって、切断ベースのアプローチは、テストされるエピジェネティックマークの数とシグナル密度の間にトレードオフがあります。これは、同じ単一細胞内の複数のエピジェネティックマークの分析を妨げます。この問題を克服するために、ゲノムDNAを切断しない単一細胞エピゲノム法が開発されました7,8

上記の切断由来の問題に加えて、トランスポザーゼベースのアプローチには他の制限があります。シングルセルエピゲノム解析では、ゲノム上のヒストンやDNA関連タンパク質の位置を知ることが重要です。現在のアプローチでは、これは未固定の単一細胞を使用し、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用を保持することによって達成されます。しかし、これは、ヒストン修飾の分析においても、アクセス可能なクロマチン領域に強いバイアスを発生させる9。ゲノム上のヒストンおよびゲノム関連タンパク質の位置は、ポリアクリルアミド足場を使用して、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質を架橋することなく保存することができる7,8。このアプローチは、タンパク質-DNAおよびタンパク質-タンパク質相互作用に依存する現在のアプローチで観察される構造バイアスを低減します。

トランスポザーゼベースのアプローチは、単一の細胞から一度だけシグナルを取得できます。したがって、シグナルのドロップオフのために単一細胞の完全なエピゲノムを描写することは困難である。再利用可能な単一細胞は、同じ単一細胞内で反復的なエピゲノム解析を可能にすることにより、現在の制限を克服するために開発されました。

Protocol

メモ: この方法の概略図を 図 1 に示します。 図1:プロトコルワークフローの概略図。ステップ7.2〜13は、概略図を使用して説明されています。各行は、プロトコルのステップを示します。緑色に着色された細胞タンパク質は?…

Representative Results

K562単一細胞は、ステップ8に記載されるプロトコルを用いて生成された( 図5参照)。単一細胞は、ポリアクリルアミドビーズの外層に包埋した。細胞DNAを染色し、DNA染色用のインターカレーター色素を用いて可視化した。 図5:生成され…

Discussion

この記事では、再利用可能な単一細胞7を使用した最近報告された単一細胞マルチエピゲノム解析の段階的なプロトコルについて説明します。後続の段落では、プロトコルの潜在的な制限を強調して、重要なポイントについて説明します。

プロトコル全体(ステップ7.2〜13から)の重要なポイントの1つは、DNase汚染を回避することです。1つの細胞にはゲノ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

プロジェクトの概念化段階でコメントをくださったDavid Sanchez-Martin博士とChristopher B. Buck博士に感謝します。また、予備実験の支援を提供してくれたGenomics Core、Center for Cancer Research、National Cancer Institute、National Institutes of Health、および計算分析のアドバイスを提供してくれたCollaborative Bioinformatics Resource、CCR、NCI、NIHにも感謝します。この方法で使用されるDNAポリメラーゼの最適化を支援してくれたAnna Word氏に感謝します。この研究では、NIHHPCバイオウルフクラスター(http://hpc.nih.gov)の計算リソースを利用しました。このプロジェクトは、がん研究センター、国立がん研究所、国立衛生研究所、NCIディレクターズイノベーションアワード(#397172)、および契約番号HHSN261200800001Eに基づく国立がん研究所からの連邦資金によってサポートされています。Tom Misteli Drs、Carol Thiele、Douglas R. Lowy、および細胞腫瘍学研究所のすべてのメンバーに、生産的なコメントをいただき、感謝します。

Materials

10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

References

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Cite This Article
Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

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