Cellule unique réutilisable pour des analyses épigénomiques itératives
Summary
Le présent protocole décrit une méthode unicellulaire pour les analyses épigénomiques itératives utilisant une cellule unique réutilisable. La cellule unique réutilisable permet d’analyser plusieurs marques épigénétiques dans la même cellule unique et de valider statistiquement les résultats.
Abstract
Les analyses actuelles de l’épigénome unicellulaire sont conçues pour un usage unique. La cellule est éliminée après une seule utilisation, ce qui empêche l’analyse de plusieurs marques épigénétiques dans une seule cellule et nécessite des données provenant d’autres cellules pour distinguer le signal du bruit de fond expérimental dans une seule cellule. Cet article décrit une méthode permettant de réutiliser la même cellule unique pour des analyses épigénomiques itératives.
Dans cette méthode expérimentale, les protéines cellulaires sont d’abord ancrées à un polymère polyacrylamide au lieu de les réticuler avec la protéine et l’ADN, atténuant ainsi les biais structurels. Cette étape critique permet des expériences répétées avec la même cellule unique. Ensuite, une amorce aléatoire avec une séquence d’échafaudage pour la ligature de proximité est recuite à l’ADN génomique, et la séquence génomique est ajoutée à l’amorce par extension en utilisant une ADN polymérase. Par la suite, un anticorps contre un marqueur épigénétique et des IgG témoins, chacun marqué avec des sondes ADN différentes, sont liés aux cibles respectives dans la même cellule unique.
La ligature de proximité est induite entre l’amorce aléatoire et l’anticorps en ajoutant un ADN connecteur avec des séquences complémentaires à la séquence d’échafaudage de l’amorce aléatoire et à la sonde anticorps-ADN. Cette approche intègre l’information sur les anticorps et les séquences génomiques proches dans un seul produit d’ADN de ligature de proximité. En permettant des expériences répétées avec la même cellule unique, cette méthode permet une augmentation de la densité de données d’une cellule rare et une analyse statistique en utilisant uniquement des données d’IgG et d’anticorps provenant de la même cellule. Les cellules individuelles réutilisables préparées par cette méthode peuvent être stockées pendant au moins quelques mois et réutilisées ultérieurement pour élargir la caractérisation épigénétique et augmenter la densité des données. Cette méthode offre de la flexibilité aux chercheurs et à leurs projets.
Introduction
La technologie unicellulaire entre dans l’ère de la multiomique unicellulaire, qui intègre des technologies omiques unicellulairesindividuelles 1. Récemment, la transcriptomique unicellulaire a été combinée avec des méthodes de détection de l’accessibilité de la chromatine (scNMT-seq2 et SHARE-seq3) ou des modifications des histones (Paired-seq4 et Paired-Tag5). Plus récemment, la transcriptomique et la protéomique unicellulaires ont été intégrées à l’accessibilité de la chromatine (DOGMA-seq6). Ces méthodes utilisent un marquage basé sur la transposase pour détecter l’accessibilité de la chromatine ou les modifications des histones.
Les approches basées sur la transposase clivent l’ADN génomique et ajoutent un code-barres ADN à la fin du fragment d’ADN génomique. Chaque fragment génomique clivé ne peut accepter que jusqu’à deux codes-barres ADN (= une marque épigénétique par site de clivage), et l’ADN génomique au site de clivage est perdu. Par conséquent, les approches basées sur le clivage ont un compromis entre le nombre de marques épigénétiques testées et la densité du signal. Cela entrave l’analyse de plusieurs marques épigénétiques dans la même cellule. Une méthode épigénomique unicellulaire qui ne clive pas l’ADN génomique a été développée pour surmonter ce problème 7,8.
En plus de la question dérivée du clivage mentionnée ci-dessus, les approches basées sur la transposase ont d’autres limites. Dans l’analyse de l’épigénome unicellulaire, il est essentiel de connaître l’emplacement des histones et des protéines associées à l’ADN sur le génome. Dans les approches actuelles, cela est accompli en utilisant des cellules uniques non fixées et en conservant les interactions protéine-ADN et protéine-protéine. Cependant, cela génère un fort biais vers les régions chromatiniques accessibles, même dans l’analyse des modifications des histones 9. L’emplacement des histones et des protéines associées au génome sur le génome peut être préservé sans réticulation protéine-ADN et protéine-protéine, à l’aide d’un échafaudage en polyacrylamide 7,8. Cette approche réduit le biais structurel observé dans les approches actuelles qui dépendent des interactions protéine-ADN et protéine-protéine.
Les approches basées sur la transposase ne peuvent acquérir des signaux qu’une seule fois à partir d’une seule cellule. Par conséquent, il est difficile de délimiter l’épigénome complet d’une seule cellule en raison de la chute des signaux. Des cellules uniques réutilisables ont été développées pour surmonter les limitations actuelles en permettant une analyse épigénomique itérative dans la même cellule unique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit le protocole étape par étape pour l’analyse multiépigénomique unicellulaire récemment rapportée utilisant des cellules uniques réutilisables7. Dans les paragraphes suivants, nous discutons des points critiques, en soulignant les limites potentielles du protocole.
L’un des points critiques tout au long du protocole (des étapes 7.2 à 13) est d’éviter la contamination par la DNase. Une seule cellule n’a que deux copies d’ADN génomi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs David Sanchez-Martin et Christopher B. Buck pour leurs commentaires au cours de la phase de conceptualisation du projet. Nous remercions également le Genomics Core, le Center for Cancer Research, le National Cancer Institute, les National Institutes of Health pour leur aide dans les expériences préliminaires, et le Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH pour leurs conseils en matière d’analyse informatique. Nous remercions Mme Anna Word pour son aide à l’optimisation des ADN polymérases utilisées dans la méthode. Ce travail a utilisé les ressources informatiques du cluster Biowulf (http://hpc.nih.gov) du NIHHPC. Ce projet est soutenu par le programme intra-muros du Center for Cancer Research, du National Cancer Institute, des National Institutes of Health, du NCI Director’s Innovation Award (#397172) et des fonds fédéraux du National Cancer Institute sous le contrat n ° HHSN261200800001E. Nous remercions les Drs Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy et tous les membres du Laboratoire d’oncologie cellulaire pour leurs commentaires productifs.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
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