Summary

Wiederverwendbare Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen

Published: February 11, 2022
doi:

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Einzelzellmethode für iterative epigenomische Analysen unter Verwendung einer wiederverwendbaren Einzelzelle. Die wiederverwendbare Einzelzelle ermöglicht die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Einzelzelle und die statistische Validierung der Ergebnisse.

Abstract

Aktuelle Einzelzell-Epigenomanalysen sind für den einmaligen Gebrauch konzipiert. Die Zelle wird nach einmaliger Verwendung verworfen, wodurch die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in einer einzelnen Zelle verhindert wird und Daten von anderen Zellen benötigt werden, um das Signal vom experimentellen Hintergrundrauschen in einer einzelnen Zelle zu unterscheiden. In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, mit der dieselbe Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen wiederverwendet werden kann.

Bei dieser experimentellen Methode werden zelluläre Proteine zunächst an einem Polyacrylamid-Polymer verankert, anstatt sie mit Protein und DNA zu vernetzen, wodurch strukturelle Verzerrungen verringert werden. Dieser kritische Schritt ermöglicht wiederholte Experimente mit derselben Einzelzelle. Als nächstes wird ein zufälliger Primer mit einer Gerüstsequenz für die Proximity-Ligation an die genomische DNA geglüht, und die genomische Sequenz wird dem Primer durch Erweiterung unter Verwendung einer DNA-Polymerase hinzugefügt. Anschließend werden ein Antikörper gegen einen epigenetischen Marker und Kontroll-IgG, die jeweils mit unterschiedlichen DNA-Sonden markiert sind, an die jeweiligen Ziele in derselben Einzelzelle gebunden.

Die Proximity-Ligation wird zwischen dem Random-Primer und dem Antikörper induziert, indem eine Konnektor-DNA mit komplementären Sequenzen an die Gerüstsequenz des Random-Primers und der Antikörper-DNA-Sonde angehängt wird. Dieser Ansatz integriert Antikörperinformationen und benachbarte Genomsequenzen in einem einzigen DNA-Produkt der Proximity-Ligation. Durch die Ermöglichung wiederholter Experimente mit derselben Einzelzelle ermöglicht diese Methode eine Erhöhung der Datendichte einer seltenen Zelle und eine statistische Analyse, bei der nur IgG- und Antikörperdaten derselben Zelle verwendet werden. Die auf diese Weise hergestellten wiederverwendbaren Einzelzellen können mindestens einige Monate gelagert und später wiederverwendet werden, um die epigenetische Charakterisierung zu erweitern und die Datendichte zu erhöhen. Diese Methode bietet Forschern und ihren Projekten Flexibilität.

Introduction

Die Single-Cell-Technologie tritt in die Ära der Single-Cell-Multiomics ein, bei der einzelne Single-Cell-Omics-Technologien integriertwerden 1. In jüngster Zeit wurde die Einzelzell-Transkriptomik mit Methoden zum Nachweis der Chromatinzugänglichkeit (scNMT-seq2 und SHARE-seq3) oder Histonmodifikationen (Paired-seq4 und Paired-Tag5) kombiniert. In jüngerer Zeit wurden Einzelzell-Transkriptomik und Proteomik in die Chromatin-Zugänglichkeit integriert (DOGMA-seq6). Diese Methoden verwenden Transposase-basiertes Tagging, um die Zugänglichkeit von Chromatin oder Histonmodifikationen zu erkennen.

Transposase-basierte Ansätze spalten genomische DNA und fügen am Ende des genomischen DNA-Fragments einen DNA-Barcode hinzu. Jedes gespaltene genomische Fragment kann nur bis zu zwei DNA-Barcodes (= eine epigenetische Markierung pro Spaltstelle) aufnehmen, und die genomische DNA an der Spaltstelle geht verloren. Daher haben spaltungsbasierte Ansätze einen Kompromiss zwischen der Anzahl der getesteten epigenetischen Markierungen und der Signaldichte. Dies erschwert die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Zelle. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine einzelzellige epigenomische Methode entwickelt, bei der die genomische DNA nicht gespalten wird 7,8.

Zusätzlich zu dem oben erwähnten Problem der Spaltung weisen Transposase-basierte Ansätze weitere Einschränkungen auf. Bei der Einzelzell-Epigenomanalyse ist es von entscheidender Bedeutung, die Position von Histonen und DNA-assoziierten Proteinen im Genom zu kennen. In aktuellen Ansätzen wird dies durch die Verwendung unfixierter Einzelzellen und die Beibehaltung von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen erreicht. Dies führt jedoch zu einer starken Verzerrung zugänglicher Chromatinregionen, selbst bei der Analyse von Histonmodifikationen 9. Die Lage von Histonen und genomassoziierten Proteinen auf dem Genom kann ohne Vernetzung von Protein-DNA und Protein-Protein unter Verwendung eines Polyacrylamid-Gerüsts erhalten werden 7,8. Dieser Ansatz reduziert die strukturelle Verzerrung, die bei aktuellen Ansätzen beobachtet wird, die von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen abhängen.

Transposase-basierte Ansätze können Signale nur einmal von einer einzelnen Zelle erfassen. Daher ist es aufgrund des Abfalls der Signale schwierig, das gesamte Epigenom einer einzelnen Zelle abzugrenzen. Wiederverwendbare Einzelzellen wurden entwickelt, um die derzeitigen Einschränkungen zu überwinden, indem sie eine iterative epigenomische Analyse in derselben Einzelzelle ermöglichen.

Protocol

HINWEIS: Eine schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokoll-Workflows. Die Schritte 7.2-13 werden anhand schematischer Darstellungen erläutert. Jede Zeile gibt einen Schritt im Protokoll an. Ein grün eingefärbtes zellul?…

Representative Results

K562-Einzelzellen wurden unter Verwendung des in Schritt 8 beschriebenen Protokolls erzeugt (siehe Abbildung 5). Einzelne Zellen wurden in die äußere Schicht des Polyacrylamid-Beads eingebettet. Die Zell-DNA wurde gefärbt und mit einem Interkalatorfarbstoff für die DNA-Färbung visualisiert. Abbildung 5: Ge…

Discussion

Dieser Artikel beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll für die kürzlich berichtete multiepigenomische Einzelzellanalyse mit wiederverwendbaren Einzelzellen7. In den folgenden Abschnitten diskutieren wir kritische Punkte und betonen mögliche Einschränkungen des Protokolls.

Einer der kritischen Punkte im gesamten Protokoll (aus den Schritten 7.2-13) ist die Vermeidung einer DNase-Kontamination. Eine einzelne Zelle hat nur zwei Kopien der genomischen DNA. Daher …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. David Sanchez-Martin und Dr. Christopher B. Buck für ihre Kommentare während der Konzeptphase des Projekts. Wir danken auch dem Genomics Core, dem Center for Cancer Research, dem National Cancer Institute, den National Institutes of Health für die Hilfe bei vorläufigen Experimenten und der Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH für die Beratung bei der computergestützten Analyse. Wir danken Frau Anna Word für ihre Hilfe bei der Optimierung der in der Methode verwendeten DNA-Polymerasen. Diese Arbeit nutzte die Rechenressourcen des NIHHPC-Biowulf-Clusters (http://hpc.nih.gov). Dieses Projekt wird durch das Intramurale Programm des Center for Cancer Research, des National Cancer Institute, der National Institutes of Health, des NCI Director’s Innovation Award (#397172) und Bundesmittel des National Cancer Institute unter der Vertragsnummer HHSN261200800001E unterstützt. Wir danken Dr. Tom Misteli, Dr. Carol Thiele, Dr. Douglas R. Lowy und allen Mitgliedern des Laboratory of Cellular Oncology für ihre produktiven Kommentare.

Materials

10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

References

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Cite This Article
Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

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