Yinelemeli epigenomik analizler için yeniden kullanılabilir tek hücre
Summary
Mevcut protokol, yeniden kullanılabilir tek bir hücre kullanarak yinelemeli epigenomik analizler için tek hücreli bir yöntemi açıklamaktadır. Yeniden kullanılabilir tek hücre, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analizine ve sonuçların istatistiksel olarak doğrulanmasına izin verir.
Abstract
Mevcut tek hücreli epigenom analizleri tek kullanım için tasarlanmıştır. Hücre tek bir kullanımdan sonra atılır, tek bir hücrede çoklu epigenetik işaretlerin analizini önler ve sinyali tek bir hücredeki deneysel arka plan gürültüsünden ayırt etmek için diğer hücrelerden veri gerektirir. Bu makalede, yinelemeli epigenomik analizler için aynı tek hücreyi yeniden kullanma yöntemi açıklanmaktadır.
Bu deneysel yöntemde, hücresel proteinler ilk önce protein ve DNA’ya çapraz bağlamak yerine bir poliakrilamid polimere bağlanır ve yapısal önyargıyı hafifletir. Bu kritik adım, aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere izin verir. Daha sonra, yakınlık ligasyonu için bir iskele dizisine sahip rastgele bir astar, genomik DNA’ya tavlanır ve genomik dizi, bir DNA polimeraz kullanılarak genişletilerek primer’e eklenir. Daha sonra, her biri farklı DNA probları ile etiketlenmiş bir epigenetik belirteç ve kontrol IgG’ye karşı bir antikor, aynı tek hücredeki ilgili hedeflere bağlanır.
Rastgele primer ve antikor arasında, rastgele primer ve antikor-DNA probunun iskele dizisine tamamlayıcı dizilere sahip bir bağlayıcı DNA eklenerek yakınlık ligasyonu indüklenir. Bu yaklaşım, antikor bilgisini ve yakındaki genom dizilerini, yakınlık ligasyonunun tek bir DNA ürününde bütünleştirir. Aynı tek hücreyle tekrarlanan deneylere olanak tanıyarak, bu yöntem nadir bir hücreden veri yoğunluğunda bir artışa ve aynı hücreden sadece IgG ve antikor verilerini kullanarak istatistiksel analize izin verir. Bu yöntemle hazırlanan yeniden kullanılabilir tek hücreler en az birkaç ay saklanabilir ve daha sonra epigenetik karakterizasyonu genişletmek ve veri yoğunluğunu artırmak için tekrar kullanılabilir. Bu yöntem araştırmacılara ve projelerine esneklik sağlar.
Introduction
Tek hücreli teknoloji, bireysel tek hücreli omik teknolojilerini entegre eden tek hücreli multiomik çağına giriyor1. Son zamanlarda, tek hücreli transkriptomikler, kromatin erişilebilirliğini (scNMT-seq2 ve SHARE-seq3) veya histon modifikasyonlarını (Paired-seq4 ve Paired-Tag5) tespit etmek için yöntemlerle birleştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, tek hücreli transkriptomik ve proteomik, kromatin erişilebilirliği ile entegre edilmiştir (DOGMA-seq6). Bu yöntemler, kromatin erişilebilirliğini veya histon modifikasyonlarını tespit etmek için transpozaz tabanlı etiketleme kullanır.
Transpozaz bazlı yaklaşımlar genomik DNA’yı parçalara ayırır ve genomik DNA fragmanının sonuna bir DNA barkodu ekler. Her parçalanmış genomik parça sadece iki DNA barkodunu (= bölünme bölgesi başına bir epigenetik işaret) kabul edebilir ve bölünme bölgesindeki genomik DNA kaybolur. Bu nedenle, bölünmeye dayalı yaklaşımlar, test edilen epigenetik işaretlerin sayısı ile sinyal yoğunluğu arasında bir dengeye sahiptir. Bu, aynı tek hücredeki çoklu epigenetik işaretlerin analizini engeller. Bu sorunun üstesinden gelmek için genomik DNA’yı parçalamayan tek hücreli bir epigenomik yöntem geliştirilmiştir 7,8.
Yukarıda bahsedilen bölünme kaynaklı soruna ek olarak, transpozaz tabanlı yaklaşımların başka sınırlamaları da vardır. Tek hücreli epigenom analizinde, histonların ve DNA ile ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yerini bilmek çok önemlidir. Mevcut yaklaşımlarda bu, sabit olmayan tek hücreler kullanılarak ve protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerinin tutulmasıyla gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, histon modifikasyonlarının analizinde bile erişilebilir kromatin bölgelerine güçlü bir önyargı oluşturur 9. Histonların ve genomla ilişkili proteinlerin genom üzerindeki yeri, bir poliakrilamid iskelesi 7,8 kullanılarak protein-DNA ve protein-proteini çapraz bağlamadan korunabilir. Bu yaklaşım, protein-DNA ve protein-protein etkileşimlerine dayanan mevcut yaklaşımlarda gözlenen yapısal önyargıyı azaltır.
Transpozaz tabanlı yaklaşımlar, tek bir hücreden yalnızca bir kez sinyal alabilir. Bu nedenle, sinyallerin düşmesi nedeniyle tek bir hücrenin tam epigenomunu tanımlamak zordur. Yeniden kullanılabilir tek hücreler, aynı tek hücrede yinelemeli epigenomik analize izin vererek mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, yeniden kullanılabilir tek hücreler7 kullanılarak yakın zamanda bildirilen tek hücreli multiepigenomik analiz için adım adım protokol açıklanmaktadır. Sonraki paragraflarda, protokoldeki potansiyel sınırlamaları vurgulayarak kritik noktaları tartışıyoruz.
Protokol boyunca kritik noktalardan biri (7.2-13. adımlardan itibaren) DNaz kontaminasyonunu önlemektir. Tek bir hücre, genomik DNA’nın sadece iki kopyasına sahiptir. Bu nedenle, ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. David Sanchez-Martin ve Christopher B. Buck’a projenin kavramsallaştırma aşamasındaki yorumları için teşekkür ederiz. Ayrıca, ön deneylerde yardım için Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institutes, National Institute of Health’e ve hesaplamalı analizde tavsiye için Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH’ye teşekkür ederiz. Yöntemde kullanılan DNA polimerazlarının optimizasyonuna yardımcı olduğu için Bayan Anna Word’e teşekkür ederiz. Bu çalışmada NIHHPC Biowulf kümesinin (http://hpc.nih.gov) hesaplama kaynakları kullanılmıştır. Bu proje, Kanser Araştırmaları Merkezi’nin Intramural Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NCI Direktörünün İnovasyon Ödülü (#397172) ve Ulusal Kanser Enstitüsü’nden HHSN261200800001E Sözleşme No’lu Federal fonlar tarafından desteklenmektedir. Dr. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy ve Hücresel Onkoloji Laboratuvarı’nın tüm üyelerine verimli yorumları için teşekkür ederiz.
Materials
| 10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
| 200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
| Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
| Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
| All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
| Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
| Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
| Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
| Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
| BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
| Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
| Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
| BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
| CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
| CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
| Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
| Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
| DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
| DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
| DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
| DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
| DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
| DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
| DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
| dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
| Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
| Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
| IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
| Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
| K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
| Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
| LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
| LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
| NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
| NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
| Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
| NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
| OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
| OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
| Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
| PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
| PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
| QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
| Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
| S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
| S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
| Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
| Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
| Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
| Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
| SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
| ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
| TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
| TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
| Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
| Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |
References
- Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
- Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
- Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
- Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
- Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
- Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
- Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
- Tosato, G., Ohnuki, H. . Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , (2021).
- Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
- Weast, R. C., Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H., et al. . Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. , (1975).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
- Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
