Summary

خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام للتحليلات الجينومية التكرارية

Published: February 11, 2022
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة الخلية الواحدة للتحليلات فوق الجينية التكرارية باستخدام خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام. تسمح الخلية المفردة القابلة لإعادة الاستخدام بتحليل العلامات اللاجينية المتعددة في نفس الخلية المفردة والتحقق الإحصائي من النتائج.

Abstract

تم تصميم تحليلات epigenome أحادية الخلية الحالية للاستخدام مرة واحدة. يتم التخلص من الخلية بعد استخدام واحد ، مما يمنع تحليل العلامات اللاجينية المتعددة في خلية واحدة ويتطلب بيانات من خلايا أخرى لتمييز الإشارة عن ضوضاء الخلفية التجريبية في خلية واحدة. تصف هذه الورقة طريقة لإعادة استخدام نفس الخلية المفردة للتحليلات فوق الجينية التكرارية.

في هذه الطريقة التجريبية ، يتم تثبيت البروتينات الخلوية أولا على بوليمر بولي أكريلاميد بدلا من ربطها بالبروتين والحمض النووي ، مما يخفف من التحيز الهيكلي. تسمح هذه الخطوة الحاسمة بإجراء تجارب متكررة مع نفس الخلية المفردة. بعد ذلك ، يتم تلدين التمهيدي العشوائي مع تسلسل سقالة لربط القرب إلى الحمض النووي الجينومي ، ويتم إضافة التسلسل الجينومي إلى التمهيدي بالامتداد باستخدام بوليميراز الحمض النووي. بعد ذلك ، يرتبط الجسم المضاد ضد علامة جينية وتحكم IgG ، كل منها يحمل تحقيقات مختلفة للحمض النووي ، بالأهداف المعنية في نفس الخلية الواحدة.

يتم تحفيز ربط القرب بين التمهيدي العشوائي والجسم المضاد عن طريق إضافة الحمض النووي الموصل مع تسلسلات تكميلية إلى تسلسل سقالة التمهيدي العشوائي ومسبار الحمض النووي للجسم المضاد. يدمج هذا النهج معلومات الأجسام المضادة وتسلسل الجينوم القريب في منتج DNA واحد لربط القرب. من خلال تمكين التجارب المتكررة مع نفس الخلية المفردة ، تسمح هذه الطريقة بزيادة كثافة البيانات من خلية نادرة والتحليل الإحصائي باستخدام بيانات IgG والأجسام المضادة فقط من نفس الخلية. يمكن تخزين الخلايا المفردة القابلة لإعادة الاستخدام المحضرة بهذه الطريقة لبضعة أشهر على الأقل وإعادة استخدامها لاحقا لتوسيع التوصيف اللاجيني وزيادة كثافة البيانات. توفر هذه الطريقة المرونة للباحثين ومشاريعهم.

Introduction

تدخل تقنية الخلية الواحدة عصر تعدد الخلايا المفردة ، والذي يدمج تقنيات omics الفردية أحادية الخلية1. في الآونة الأخيرة ، تم دمج النسخ أحادي الخلية مع طرق للكشف عن إمكانية الوصول إلى الكروماتين (scNMT-seq2 و SHARE-seq3) أو تعديلات هيستون (Paired-seq4 و Paired-Tag5). في الآونة الأخيرة ، تم دمج النسخ أحادي الخلية والبروتينات مع إمكانية الوصول إلى الكروماتين (DOGMA-seq6). تستخدم هذه الطرق العلامات المستندة إلى transposase للكشف عن إمكانية الوصول إلى الكروماتين أو تعديلات الهستون.

تشق الأساليب القائمة على Transposase الحمض النووي الجينومي وتضيف رمزا شريطيا للحمض النووي في نهاية جزء الحمض النووي الجينومي. يمكن لكل جزء جينومي مشقوق قبول ما يصل إلى رمزين شريطيين للحمض النووي (= علامة جينية واحدة لكل موقع انقسام) ، ويتم فقد الحمض النووي الجينومي في موقع الانقسام. لذلك ، فإن النهج القائمة على الانقسام لها مفاضلة بين عدد العلامات اللاجينية التي تم اختبارها وكثافة الإشارة. هذا يعيق تحليل العلامات اللاجينية المتعددة في نفس الخلية الواحدة. تم تطوير طريقة فوق جينومية أحادية الخلية لا تشق الحمض النووي الجينومي للتغلب على هذه المشكلة 7,8.

بالإضافة إلى القضية المشتقة من الانقسام المذكورة أعلاه ، فإن النهج القائمة على الترانسبوزاز لها قيود أخرى. في تحليل epigenome أحادي الخلية ، من الأهمية بمكان معرفة موقع الهستونات والبروتينات المرتبطة بالحمض النووي على الجينوم. في الأساليب الحالية ، يتم تحقيق ذلك باستخدام خلايا مفردة غير ثابتة والاحتفاظ بتفاعلات البروتين والحمض النووي والبروتين والبروتين. ومع ذلك ، فإن هذا يولد تحيزا قويا لمناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ، حتى في تحليل تعديلات الهستون 9. يمكن الحفاظ على موقع الهستونات والبروتينات المرتبطة بالجينوم على الجينوم دون ربط البروتين – الحمض النووي والبروتين – البروتين ، باستخدام سقالة بولي أكريلاميد 7,8. يقلل هذا النهج من التحيز الهيكلي الملاحظ في الأساليب الحالية التي تعتمد على تفاعلات البروتين والحمض النووي والبروتين والبروتين.

يمكن للنهج القائمة على Transposase الحصول على إشارات مرة واحدة فقط من خلية واحدة. لذلك ، من الصعب تحديد epigenome الكامل لخلية واحدة بسبب انخفاض الإشارات. تم تطوير خلايا مفردة قابلة لإعادة الاستخدام للتغلب على القيود الحالية من خلال السماح بالتحليل الجيني التكراري في نفس الخلية المفردة.

Protocol

ملاحظة: يظهر تمثيل تخطيطي للطريقة في الشكل 1. الشكل 1: تمثيل تخطيطي لسير عمل البروتوكول. يتم شرح الخطوات 7.2-13 من خلال التمثيلات التخطيطية. يشير كل صف إلى خطوة في البروتو?…

Representative Results

تم إنشاء خلايا مفردة K562 باستخدام البروتوكول الموضح في الخطوة 8 (انظر الشكل 5). تم تضمين خلايا مفردة في الطبقة الخارجية من حبة بولي أكريلاميد. تم تلطيخ الحمض النووي للخلية وتصوره باستخدام صبغة مقحمة لتلطيخ الحمض النووي. <img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="…

Discussion

توضح هذه المقالة البروتوكول خطوة بخطوة للتحليل متعدد الخلايا أحادية الخلية الذي تم الإبلاغ عنه مؤخرا باستخدام خلايا مفردة قابلة لإعادة الاستخدام7. في الفقرات اللاحقة ، نناقش النقاط الحرجة ، مع التركيز على القيود المحتملة في البروتوكول.

إحدى النقاط الحرجة في ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور ديفيد سانشيز مارتن وكريستوفر ب. باك على تعليقاتهما خلال مرحلة وضع المفاهيم للمشروع. كما نشكر مركز الجينوم ، ومركز أبحاث السرطان ، والمعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة للمساعدة في التجارب الأولية ، وموارد المعلوماتية الحيوية التعاونية ، و CCR ، و NCI ، و NIH للحصول على المشورة في التحليل الحسابي. نشكر السيدة آنا وورد على المساعدة في تحسين بوليميراز الحمض النووي المستخدم في الطريقة. استخدم هذا العمل الموارد الحسابية لمجموعة NIHHPC Biowulf (http://hpc.nih.gov). يتم دعم هذا المشروع من قبل البرنامج الداخلي لمركز أبحاث السرطان ، والمعهد الوطني للسرطان ، والمعاهد الوطنية للصحة ، وجائزة الابتكار لمدير المعهد الوطني للسرطان (# 397172) ، والأموال الفيدرالية من المعهد الوطني للسرطان بموجب العقد رقم HHSN261200800001E. نشكر الدكاترة توم ميستيلي وكارول ثيل ودوغلاس آر لوي وجميع أعضاء مختبر الأورام الخلوية على تعليقاتهم المثمرة.

Materials

10x CutSmart buffer New England BioLabs B6004 10x Digestion buffer
200 proof ethanol Warner-Graham Company 200 proof Ethanol
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] Epigentek A-1018-100 Anti-5hmC
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Cell counter
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology MilliporeSigma 01697-500ML 40% acrylamide solution
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 Keyence BZ-X710 Scanning microscope
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit MilliporeSigma UFC510024 Ultrafiltration cassette
Ammonium persulfate for molecular biology MilliporeSigma A3678-100G Ammonium persulfate powder
Anhydrous DMF Vector laboratories S-4001-005 Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF)
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] Abcam ab5408 Anti-Pol II
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody Abcam ab60950 Anti-Med1
BciVI New England BioLabs R0596L BciVI
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology MilliporeSigma B8667-5ML 20% BSA (Table 7)
Bst DNA Polymerase, Large Fragment New England BioLabs M0275L Bst DNA polymerase
BT10 Series 10 µl Barrier Tip NEPTUNE BT10 P10 low-retention tip
CellCelector Automated Lab Solutions N/A Automated single cell picking robot
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA Automated Lab Solutions CC0079 4 nL nanowell plate
Chloroform MilliporeSigma Chloroform
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate Corning 3596 Flat-bottom 96-well plates
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase New England BioLabs M0259L Exo DNA polymerase
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30108035 0.5 mL DNA low-binding tube
DNA Oligo, 1st random primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 1st random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd random primer
DNA Oligo, 2nd synthesis primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 2nd synthesis primer
DNA Oligo, Ligation Adaptor Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Ligation Adaptor
DNA Oligo, Reverse Transcription primer Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 Reverse Transcription primer
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303L DNase I (RNase-free, 4 U).
DNase I Reaction Buffer New England BioLabs B0303S 10x DNase I buffer (NEB)
dNTP Mix (10 mM each) Thermo Fisher R0192 10 mM dNTPs
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated MilliporeSigma F4135-500ML Fetal bovine serum
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England BioLabs E2040S In-vitro-transcription master mix
Histone H3K27ac antibody Active motif 39133 Anti-H3K27ac
Histone H3K27me3 antibody Active motif 39155 Anti-H3K27me3
IgG from rabbit serum Millipore Sigma I5006-10MG Control IgG
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized MilliporeSigma 747467-1G NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder
K-562 American Type Culture Collection (ATCC) CCL-243 cells
Linear Acrylamide (5 mg/mL) Thermo Fisher AM9520 Linear Acrylamide
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter Logos Biosystems L20001 Cell counter
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides Logos Biosystems L12001 Cell counter
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil MilliporeSigma M5904-500ML Mineral oil
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology MilliporeSigma T7024-100ML N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine
NaCl (5 M), RNase-free Thermo Fisher AM9760G 5M NaCl
NanoDrop Lite Thermo Fisher 2516  Microvolume spectrophotometer
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom Opentrons N/A 2 mL deep well 96-well plate
Non-skirted 96-well PCR plate Genesee Scientific 27-405 96-well PCR plate
NuSive GTG Agarose Lonza 50081 Agarose
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution MilliporeSigma 1300-500ML 40%Acrylamide/Bis-acrylamide
OT-2 lab robot Opentrons OT2 Automated liquid handling robot
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution Electron Microscopy Sciences 15713 20% Pararmaldehyde
PBS (10x), pH 7.4 Thermo Fisher 70011044 10x PBS
PIPETMAN Classic P1000 GILSON F123602 A P1000 pipette
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 925000090 1.5 mL Protein low-binding tube
QIAgen Gel Extraction kit Qiagen 28706 A P1000 pipette
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Thermo Fisher P11495  dsDNA specific intercalator dye
Quick Ligation kit New England BioLabs M2200L T4 DNA ligase (NEB)
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor Thermo Fisher 10777019 RNAse inhibitor
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) Vector laboratories S-1004-105 Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB)
S-HyNic Vector laboratories S-1002-105 Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic)
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade MilliporeSigma 567422-100ML 3M Sodium acetate (pH 5.2)
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 Alfa Aesar J60408 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5
Sodium phosphate dibasic for molecular biology MilliporeSigma S3264-250G Na2HPO4
Sodium phosphate monobasic for molecular biology MilliporeSigma S3139-250G NaH2PO4
SuperScript IV reverse transcriptase Thermo Fisher 18090050 Reverse transcriptase
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) Thermo Fisher S11494 An intercalator dye for DNA
T4 DNA Ligase Reaction Buffer New England BioLabs B0202S 10x T4 DNA ligase reaction buffer
ThermoPol Reaction Buffer Pack New England BioLabs B9004S 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100)
TRIzol LS reagent Thermo Fisher 10296-028 Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction
TruSeq Nano DNA library prep kit Illumina 20015965 A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction)
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for antibody
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 Integrated DNA Technologies N/A, see Table 3 An amine-modified DNA probe for control IgG
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020 0.5M EDTA, pH 8.0
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher 10977023 Ultrapure water
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher 89882 Desalting column

References

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. . Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H., et al. . Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. , (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12 (2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696 (2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

Play Video

Cite This Article
Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses. J. Vis. Exp. (180), e63456, doi:10.3791/63456 (2022).

View Video