Биоразведка экстремофильных микроорганизмов для борьбы с загрязнением окружающей среды
Summary
Выделение устойчивых к тяжелым металлам микробов из геотермальных источников является актуальной темой для развития биоремедиации и биосистем мониторинга окружающей среды. Это исследование обеспечивает методологический подход к выделению и идентификации устойчивых к тяжелым металлам бактерий из горячих источников.
Abstract
Геотермальные источники богаты различными ионами металлов из-за взаимодействия между породой и водой, которое происходит в глубоком водоносном горизонте. Кроме того, из-за сезонных колебаний рН и температуры в этих экстремальных средах периодически наблюдаются колебания в элементном составе, влияющие на экологические микробные сообщества. Экстремофильные микроорганизмы, которые процветают в вулканических тепловых жерлах, разработали механизмы сопротивления для обработки нескольких ионов металлов, присутствующих в окружающей среде, тем самым принимая участие в сложных биогеохимических циклах металлов. Более того, экстремофилы и их продукты нашли широкую точку опоры на рынке, и это особенно верно для их ферментов. В этом контексте их характеристика является функциональной для развития биосистем и биопроцессов для мониторинга окружающей среды и биоремедиации. На сегодняшний день выделение и культивирование в лабораторных условиях экстремофильных микроорганизмов по-прежнему представляют собой узкое место для полного использования их биотехнологического потенциала. В этой работе описывается упрощенный протокол выделения термофильных микроорганизмов из горячих источников, а также их генотипическая и фенотипическая идентификация посредством следующих этапов: 1) отбор проб микроорганизмов с геотермальных участков (“Пишарелли”, вулканический район Кампи Флегрей в Неаполе, Италия); 2) выделение микроорганизмов, устойчивых к тяжелым металлам; 3) идентификация микробных изолятов; (4) Фенотипическая характеристика изолятов. Методологии, описанные в настоящей работе, могут в целом применяться также для выделения микроорганизмов из других экстремальных сред.
Introduction
Экстремальные среды на нашей планете являются отличными источниками микроорганизмов, способных переносить суровые условия (т.е. температуру, рН, соленость, давление и тяжелые металлы)1,2, это Исландия, Италия, США, Новая Зеландия, Япония, Центральная Африка и Индия, наиболее признанные и изученные вулканические районы 3,4,5,6,7,8,9 . Термофилы эволюционировали в суровых условиях в диапазоне температур от 45 °C до 80 °C 10,11,12. Термофильные микроорганизмы, принадлежащие к архейному или бактериальному царству, являются резервуаром для изучения биоразнообразия, филогенеза и производства эксклюзивных биомолекул для промышленного применения 13,14,15,16. Действительно, в последние десятилетия постоянный промышленный спрос на мировом рынке способствовал использованию экстремофилов и термозимов для их диверсифицированного применения в нескольких биотехнологических областях 17,18,19.
Горячие источники, где организмы живут в консорциумах, являются богатыми источниками биоразнообразия, тем самым представляя собой привлекательную среду обитания для изучения микробной экологии20,21. Кроме того, эти богатые вулканическими металлами районы обычно колонизируются микроорганизмами, которые развили системы толерантности, чтобы выжить и адаптироваться к присутствию тяжелых металлов22,23 и поэтому активно участвуют в их биогеохимических циклах. В настоящее время тяжелые металлы считаются приоритетными загрязнителями для человека и окружающей среды. Устойчивые к тяжелым металлам микроорганизмы способны солюбилизировать и выбрасывать металлы, трансформируя их и реконструируя свои экосистемы24,25. Понимание молекулярных механизмов резистентности к тяжелым металлам является горячей темой для срочной разработки новых зеленых подходов 26,27,28. В этом контексте открытие новых толерантных бактерий представляет собой отправную точку для разработки новых стратегий биоремедиации окружающей среды24,29. В дополнение к усилиям по исследованию гидротермальной среды с помощью микробиологических процедур и расширению знаний о роли гена (генов), лежащего в основе толерантности к тяжелым металлам, микробный скрининг был проведен в районе горячих источников Кампи Флегрей в Италии. Эта богатая тяжелыми металлами среда демонстрирует мощную гидротермальную активность, фумароль и кипящие бассейны, переменные по рН и температуре в зависимости от сезонности, осадков и подземных геологических движений30. В этой перспективе мы описываем простой в применении и эффективный способ выделения бактерий, устойчивых к тяжелым металлам, например, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (названный изолятом 1) и Alicyclobacillus mali FL1832 (названный изолятом 2) из района Пишиарелли Кампи Флегрей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Горячие источники содержат неиспользованное разнообразие микробиомов с одинаково разнообразными метаболическими способностями12. Разработка стратегий выделения микроорганизмов, которые могут эффективно превращать тяжелые металлы в менее токсичные соединения<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана ERA-NET Cofund MarTERA: «FLAshMoB: Функциональная амилоидная химера для морского биозондирования», PRIN 2017-PANACEA CUP: E69E19000530001 и GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Италия. Мы благодарим д-ра Монику Пиочи и д-ра Анджелу Мормоне (Национальный институт геофизики и вулканологии, Сеционе ди Неаполь Оссерваторио Везувиано, Италия) за идентификацию и характеристику геотермального участка.
Materials
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
