التنقيب البيولوجي للكائنات الحية الدقيقة المتطرفة لمعالجة التلوث البيئي
Summary
يعد عزل الميكروبات المقاومة للمعادن الثقيلة عن الينابيع الحرارية الأرضية موضوعا ساخنا لتطوير المعالجة الحيوية والنظم الحيوية للرصد البيئي. توفر هذه الدراسة نهجا منهجيا لعزل وتحديد البكتيريا التي تتحمل المعادن الثقيلة من الينابيع الساخنة.
Abstract
الينابيع الحرارية الأرضية غنية بأيونات المعادن المختلفة بسبب التفاعل بين الصخور والمياه التي تحدث في طبقة المياه الجوفية العميقة. علاوة على ذلك ، بسبب التباين الموسمي في درجة الحموضة ودرجة الحرارة ، لوحظ بشكل دوري تقلب في تكوين العناصر داخل هذه البيئات القاسية ، مما يؤثر على المجتمعات الميكروبية البيئية. طورت الكائنات الحية الدقيقة المتطرفة التي تزدهر في الفتحات الحرارية البركانية آليات مقاومة للتعامل مع العديد من أيونات المعادن الموجودة في البيئة ، وبالتالي المشاركة في الدورات البيوجيوكيميائية المعدنية المعقدة. علاوة على ذلك ، وجدت الكائنات المتطرفة ومنتجاتها موطئ قدم واسع النطاق في السوق ، وهذا ينطبق بشكل خاص على إنزيماتها. وفي هذا السياق، فإن توصيفها وظيفي لتطوير النظم الحيوية والعمليات البيولوجية للرصد البيئي والمعالجة البيولوجية. وحتى الآن، لا يزال عزل الكائنات الحية الدقيقة المتطرفة وزراعتها تحت ظروف مختبرية يمثل عنق الزجاجة لاستغلال إمكاناتها التكنولوجية الحيوية استغلالا كاملا. ويصف هذا العمل بروتوكولا مبسطا لعزل الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة عن الينابيع الساخنة، فضلا عن تحديدها الجيني والظاهري من خلال الخطوات التالية: (1) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية (“Pisciarelli”، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية (“Pisciarelli”، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية (“Pisciarelli”، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية (“Pisciarelli”، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات الحية الدقيقة من مواقع الطاقة الحرارية الأرضية (“Pisciarelli”، وهي منطقة بركانية في كامبي فليغري في نابولي، إيطاليا)؛ (2) أخذ عينات من الكائنات (2) عزل الكائنات الحية الدقيقة المقاومة للمعادن الثقيلة؛ (3) تحديد العزلات الميكروبية؛ (4) التوصيف الظاهري للعزلات. ويمكن تطبيق المنهجيات الموصوفة في هذا العمل عموما أيضا على عزل الكائنات الحية الدقيقة عن البيئات القاسية الأخرى.
Introduction
البيئات القاسية على كوكبنا هي مصادر ممتازة للكائنات الحية الدقيقة القادرة على تحمل الظروف القاسية (أي درجة الحرارة ودرجة الحموضة والملوحة والضغط والمعادن الثقيلة)1،2 ، كونها أيسلندا وإيطاليا والولايات المتحدة الأمريكية ونيوزيلندا واليابان ووسط أفريقيا والهند ، أفضل المناطق البركانية المعترف بها والدراسة3،4،5،6،7،8،9 . تطورت محبة الحرارة في بيئات قاسية في مجموعة من درجات الحرارة من 45 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية10،11،12. الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة ، إما التي تنتمي إلى الممالك القديمة أو البكتيرية ، هي خزان لدراسة التنوع البيولوجي ، والتكاثر ، وإنتاج جزيئات حيوية حصرية للتطبيقات الصناعية 13،14،15،16. في الواقع ، في العقود الماضية ، شجع الطلب الصناعي المستمر في السوق العالمية على استغلال المحبة للمتطرفات والإنزيمات الحرارية لتطبيقاتها المتنوعة في العديد من مجالات التكنولوجيا الحيوية 17،18،19.
الينابيع الساخنة ، حيث تعيش الكائنات الحية في اتحادات ، هي مصادر غنية للتنوع البيولوجي ، وبالتالي تمثل موئلا جذابا لدراسة البيئة الميكروبية20،21. علاوة على ذلك ، فإن هذه المناطق الغنية بالمعادن البركانية تستعمرها عادة الكائنات الحية الدقيقة التي طورت أنظمة التسامح للبقاء والتكيف مع وجود المعادن الثقيلة22,23 وبالتالي تشارك بنشاط في دوراتها البيوجيوكيميائية. في الوقت الحاضر ، تعتبر المعادن الثقيلة ملوثات ذات أولوية للبشر والبيئة. الكائنات الحية الدقيقة المقاومة للمعادن الثقيلة قادرة على إذابة المعادن وترسيبها عن طريق تحويلها وإعادة تشكيل نظمها الإيكولوجية24,25. إن فهم الآليات الجزيئية لمقاومة المعادن الثقيلة هو موضوع ساخن للحاجة الملحة لتطوير نهج خضراء جديدة 26،27،28. في هذا السياق ، يمثل اكتشاف بكتيريا جديدة متسامحة نقطة انطلاق لتطوير استراتيجيات جديدة للمعالجة البيولوجية البيئية24,29. وبمرافقة الجهود المبذولة لاستكشاف البيئات الحرارية المائية من خلال الإجراءات الميكروبيولوجية وزيادة المعرفة بدور الجين (الجينات) التي تدعم تحمل المعادن الثقيلة، أجري فحص ميكروبي في منطقة الينابيع الساخنة في كامبي فليغري في إيطاليا. تظهر هذه البيئة الغنية بالمعادن الثقيلة نشاطا حراريا مائيا قويا ، وفومارول ، وبركا مغلية ، متغيرة في درجة الحموضة ودرجة الحرارة في الاعتماد على الموسمية ، وهطول الأمطار ، والحركات الجيولوجية تحت الأرض30. في هذا المنظور ، نصف طريقة سهلة التطبيق وفعالة لعزل البكتيريا المقاومة للمعادن الثقيلة ، على سبيل المثال ، Geobacillus stearothermophilus GF1631 (المسمى باسم المعزول 1) و Alicyclobacillus mali FL1832 (المسمى باسم المعزول 2) من منطقة Pisciarelli في Campi Flegrei.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحتوي الينابيع الساخنة على تنوع غير مستغل من الميكروبات ذات قدرات استقلابية متنوعة بنفس القدر12. ويمثل وضع استراتيجيات لعزل الكائنات الحية الدقيقة التي يمكنها تحويل المعادن الثقيلة بكفاءة إلى مركبات أقل سمية10 مجالا بحثيا يحظى باهتمام متزايد في جميع أنحاء العال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing” ، PRIN 2017-PANACEA CUP: E69E19000530001 و GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-BY-WASTE – reduce WASTE ، MIUR 2017-JTNK78.006 ، إيطاليا. نشكر الدكتورة مونيكا بيوتشي والدكتورة أنجيلا مورمون (المعهد الوطني للجيوفيسيكا وعلم الفولكانولوجيا، Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano، إيطاليا) على تحديد وتوصيف موقع الطاقة الحرارية الأرضية.
Materials
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
