ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי
Summary
הבידוד של מיקרובים עמידים למתכות כבדות ממעיינות גיאותרמיים הוא נושא חם לפיתוח מערכות ביולוגיות וניטור סביבתי. מחקר זה מספק גישה מתודולוגית לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים למתכות כבדות ממעיינות חמים.
Abstract
מעיינות גיאותרמיים עשירים ביוני מתכת שונים בשל האינטראקציה בין סלע למים המתרחשת באקוויפר העמוק. יתר על כן, בשל שונות עונתיות ב- pH ובטמפרטורה, תנודות בהרכב האלמנטים נצפות מעת לעת בסביבות קיצוניות אלה, ומשפיעות על קהילות המיקרוביאליות הסביבתיות. מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים המשגשגים בנביעות תרמיות געשיות פיתחו מנגנוני התנגדות לטיפול במספר יוני מתכת הנמצאים בסביבה, ובכך לוקחים חלק במחזורים ביו-גיאוכימיים מורכבים של מתכות. יתר על כן, אקסטרמופילים ומוצריהם מצאו דריסת רגל נרחבת בשוק, וזה נכון במיוחד לגבי האנזימים שלהם. בהקשר זה, האפיון שלהם פונקציונלי לפיתוח ביו-מערכות ועיבודים ביולוגיים לניטור סביבתי ולתיעוד ביולוגי. נכון להיום, הבידוד והטיפוח בתנאי מעבדה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים עדיין מהווים צוואר בקבוק לניצול מלא של הפוטנציאל הביו-טכנולוגי שלהם. עבודה זו מתארת פרוטוקול יעיל לבידוד של מיקרואורגניזמים תרמופיליים ממעיינות חמים, כמו גם את הזיהוי הגנוטיפי והפנוטיפי שלהם באמצעות השלבים הבאים: (1) דגימה של מיקרואורגניזמים מאתרים גיאותרמיים (“Pisciarelli”, אזור וולקני של קמפי פלגרי בנאפולי, איטליה); (2) בידוד של מיקרואורגניזמים עמידים למתכות כבדות; (3) זיהוי מבודדים מיקרוביאליים; (4) אפיון פנוטיפי של המבודדים. המתודולוגיות המתוארות בעבודה זו עשויות להיות מיושמות באופן כללי גם לבידוד של מיקרואורגניזמים מסביבות קיצוניות אחרות.
Introduction
הסביבות הקיצוניות על פני כדור הארץ שלנו הן מקורות מצוינים של מיקרואורגניזמים המסוגלים לסבול תנאים קשים (כלומר, טמפרטורה, pH, מליחות, לחץ ומתכות כבדות)1,2, בהיותם איסלנד, איטליה, ארה”ב, ניו זילנד, יפן, מרכז אפריקה והודו, האזורים הגעשיים המוכרים והנחקרים ביותר 3,4,5,6,7,8,9 . תרמופילים התפתחו בסביבות קשות במגוון טמפרטורות מ 45 °C (76 °F) עד 80 °C (80 °F) 10,11,12 . מיקרואורגניזמים תרמופיליים, השייכים לממלכות הארכאיות או החיידקיות, הם מאגר לחקר המגוון הביולוגי, הפילוגנזה וייצור ביומולקולות בלעדיות ליישומים תעשייתיים 13,14,15,16. ואכן, בעשורים האחרונים, הביקוש התעשייתי המתמשך בשוק העולמי עודד ניצול של אקסטרמופילים ותרמוזימים ליישומיהם המגוונים במספר תחומים ביוטכנולוגיה 17,18,19.
מעיינות חמים, שבהם אורגניזמים חיים במאגדים, הם מקורות עשירים של מגוון ביולוגי, ולכן מייצגים בית גידול אטרקטיבי לחקר אקולוגיה מיקרוביאלית20,21. יתר על כן, אזורים עשירים במתכות געשיות אלה מיושבים בדרך כלל על ידי מיקרואורגניזמים שפיתחו מערכות עמידות כדי לשרוד ולהסתגל לנוכחות של מתכות כבדות22,23 ולכן הם מעורבים באופן פעיל במחזורים הביוגיאוכימיים שלהם. כיום, מתכות כבדות נחשבות למזהמים מועדפים עבור בני אדם והסביבה. המיקרואורגניזמים העמידים למתכות כבדות מסוגלים לבודד ולזרז מתכות על ידי הפיכתן ושיפוץ המערכות האקולוגיות שלהם24,25. ההבנה של המנגנונים המולקולריים של עמידות מתכות כבדות היא נושא חם עבור הדחיפות לפתח גישות ירוקות חדשות 26,27,28. בהקשר זה, הגילוי של חיידקים סובלניים חדשים מייצג את נקודת המוצא לפיתוח אסטרטגיות חדשות לשיקום ביולוגי סביבתי24,29. בליווי המאמצים לחקור סביבות הידרותרמיות באמצעות הליכים מיקרוביולוגיים ולהגביר את הידע על תפקידם של הגנים העומדים בבסיס הסבילות למתכות כבדות, נערכה בדיקה מיקרוביאלית באזור המעיין החם של קמפי פלגרי באיטליה. סביבה זו, העשירה במתכות כבדות, מראה פעילות הידרותרמית רבת עוצמה, פומרולה ובריכות רותחות, המשתנה ב-pH ובטמפרטורה בתלות בעונתיות, גשמים ותנועות גיאולוגיות תת-קרקעיות30. בפרספקטיבה זו, אנו מתארים דרך קלה ליישום ויעילה לבודד חיידקים העמידים בפני מתכות כבדות, לדוגמה, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (שנקרא כבודד 1) ו– Alicyclobacillus mali FL1832 (שנקרא כבודד 2) מאזור Pisciarelli בקמפי פלגרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מעיינות חמים מכילים מגוון לא מנוצל של מיקרוביום עם יכולות מטבוליות מגוונות באותה מידה12. פיתוח אסטרטגיות לבידוד של מיקרואורגניזמים שיכולים להמיר ביעילות מתכות כבדות לתרכובות פחות רעילות10 מייצג תחום מחקר בעל עניין הולך וגובר ברחבי העולם. מאמר זה נועד לתאר גישה י?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: כימרה עמילואידית פונקציונלית לביוסנסינג ימי”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 ועל ידי GoodbyWaste: להשיג מוצריGOOD-ניצול על-ידי-מוצרים-להפחית פסולת, MIUR 2017-JTNK78.006, איטליה. אנו מודים לד”ר מוניקה פיוצ’י ולד”ר אנג’לה מורמונה (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, איטליה) על הזיהוי והאפיון של האתר הגיאותרמי.
Materials
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
