Summary

環境汚染に対処するための極限環境微生物のバイオプロスペクティング

Published: December 30, 2021
doi:

Summary

地熱泉からの重金属耐性微生物の単離は、バイオレメディエーションおよび環境モニタリングバイオシステムの開発にとってホットな話題である。この研究は、温泉から重金属耐性菌を単離し同定するための方法論的アプローチを提供する。

Abstract

地熱泉は、深い帯水層で起こる岩石と水の相互作用により、様々な金属イオンが豊富です。また、pHや温度の季節変動により、これらの極限環境内では元素組成の変動が周期的に観測され、微生物群集の環境に影響を与えています。火山の熱噴出孔で繁栄する極限環境微生物は、環境中に存在するいくつかの金属イオンを処理する耐性メカニズムを開発し、複雑な金属生物地球化学サイクルに参加しています。さらに、極限環境とその製品は市場で広範な足がかりを見つけており、これは特に彼らの酵素に当てはまります。この文脈において、それらの特性評価は、環境モニタリングおよびバイオレメディエーションのためのバイオシステムおよびバイオプロセスの開発に機能する。今日まで、極限環境微生物の実験室条件下での単離と培養は、依然としてバイオテクノロジーの可能性を十分に活用するためのボトルネックとなっています。この研究は、温泉からの好熱性微生物の単離のための合理化されたプロトコルと、次のステップによるそれらの遺伝子型および表現型の同定について記述している:(1)地熱地帯(「Pisciarelli」、イタリアのナポリのカンピ・フレグレイの火山地帯)からの微生物のサンプリング。(2)重金属耐性微生物の単離;(3)微生物分離株の同定;(4)分離株の表現型特性評価。この研究で説明されている方法論は、他の極端な環境からの微生物の単離にも一般的に適用される可能性がある。

Introduction

地球上の極限環境は、アイスランド、イタリア、アメリカ、ニュージーランド、日本、中央アフリカ、インドなど、過酷な条件(温度、pH、塩分濃度、圧力、重金属)に耐えることができる微生物の優れた供給源であり、最も認識され研究されている火山地域3,4,5,6,7,8,9です.好熱剤は、45°Cから80°Cまでの過酷な環境で進化してきました10,11,12。好熱性微生物は、古細菌または細菌界に属するか、生物多様性、系統発生、および産業用途のための排他的な生体分子の生産の研究のための貯蔵庫である13141516実際、過去数十年間、世界市場における継続的な産業需要は、いくつかのバイオテクノロジー分野での多様な用途のための極限環境およびサーモザイムの搾取を奨励してきた17,18,19

生物がコンソーシアムで生息する温泉は、生物多様性の豊かな源泉であり、微生物生態学を研究するのに魅力的な生息地である20,21。さらに、これらの火山性金属が豊富な地域は、重金属22,23の存在に生き残り、適応するために耐性システムを進化させた微生物によって一般的に植民地化されているため、生物地球化学的サイクルに積極的に関与しています。今日、重金属は人間と環境にとって優先的な汚染物質と考えられています。重金属耐性微生物は、金属を形質転換し、生態系を再構築することによって、金属を可溶化および沈殿させることができる24,25。重金属耐性の分子メカニズムの理解は、新しいグリーンアプローチ26,27,28を開発する緊急性のためのホットな話題です。この文脈において、新しい耐性細菌の発見は、環境バイオレメディエーションのための新しい戦略を開発するための出発点を表す24,29。微生物学的手順を通じて熱水環境を探索し、重金属耐性を支える遺伝子の役割に関する知識を増やす努力に伴い、イタリアのカンピフレグレイの温泉地域で微生物スクリーニングが行われました。この重金属が豊富な環境は、季節性、降雨量、地下の地質学的動きに応じてpHと温度が変化する強力な熱水活動、噴気孔、沸騰プールを示しています30。この視点では、重金属に耐性のある細菌、例えば、Geobacillus stearothermophilus GF1631(単離物1として命名)およびAlicyclobacillus mali FL1832(単離物2として命名)をカンピフレグレイのピシアレッリ地域から単離するための適用が容易で効果的な方法を説明する。

Protocol

1. 地熱地帯からの微生物のサンプリング 所望の温度とpHを有する場所を基準として使用してサンプリングする部位を選択する。デジタル熱電対プローブを介して物理パラメータを測定し、選択したプールまたは泥に挿入します。 20gの土壌サンプル(この場合は、Pisciarelli Solfataraの熱水サイトの泥から)を収集し、滅菌されたスプーンでそれらを拾う。選択した各サイ…

Representative Results

サンプリングサイトこのプロトコルは、温泉から重金属耐性菌を単離する方法を示すものである。本研究では、酸性・亜硫酸系地熱環境であるピシアレリ地域をサンプリングサイトとして用いた(図1)。この生態系は、火山活動に由来する攻撃的な硫黄流体の流れによって特徴付けられる。酸性 – 硫化地熱系の微生物群集は、高濃度の重金属?…

Discussion

温泉には、同様に多様な代謝能力を持つ未開発の多様な微生物叢が含まれています12。重金属を毒性の低い化合物に効率的に変換できる微生物の単離戦略の開発10 は、世界中で関心が高まっている研究分野です。この論文は、有毒化学物質に抵抗する能力を持つ微生物のスクリーニングと単離のための合理化されたアプローチを記述することを目的として?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 および GoodbyWaste: GetGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italyの支援を受けた。我々は、地熱地帯の特定と特徴付けについて、モニカ・ピオチ博士とアンジェラ・モルモン博士(Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italy)に感謝する。

Materials

Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732

References

  1. Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
  2. Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
  3. Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
  4. Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
  5. Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
  6. Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
  7. Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
  8. Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
  9. Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
  10. Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
  11. Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
  12. Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
  13. Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
  14. Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
  16. Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
  17. Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
  18. Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
  19. Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
  20. Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
  21. He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
  22. Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
  23. Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
  24. Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
  25. Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
  26. Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
  27. Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
  28. Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
  29. Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
  30. Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
  31. Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
  32. Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
  33. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
  34. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  35. Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
  36. Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
  37. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
  38. Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
  39. Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
  40. Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
  41. Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
  42. Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).

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Cite This Article
Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).

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