JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
português

Automatically Generated
Environment

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63453
, , , , ,
1Department of Biology,University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB),Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering,Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology,University of Napoli Federico II

Summary

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Abstract

As nascentes geotérmicas são ricas em vários íons metálicos devido à interação entre rocha e água que ocorre no aquífero profundo. Além disso, devido à variação sazonalidade do pH e da temperatura, a flutuação na composição do elemento é observada periodicamente dentro desses ambientes extremos, influenciando as comunidades microbianas ambientais. Microrganismos extreílicos que prosperam em aberturas térmicas vulcânicas desenvolveram mecanismos de resistência para lidar com vários íons metálicos presentes no ambiente, participando assim de ciclos biogeoquímicos metálicos complexos. Além disso, os extremófilos e seus produtos têm encontrado uma ampla base no mercado, e isso vale especialmente para suas enzimas. Nesse contexto, sua caracterização é funcional para o desenvolvimento de biossistemas e bioprocessos para monitoramento ambiental e bioremediação. Até o momento, o isolamento e o cultivo em condições laboratoriais de microrganismos extreílicos ainda representam um gargalo para a exploração plena de seu potencial biotecnológico. Este trabalho descreve um protocolo simplificado para o isolamento de microrganismos termofílicos de fontes termais, bem como sua identificação genotípica e fenotípica através das seguintes etapas: (1) Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos (“Pisciarelli”, uma área vulcânica de Campi Flegrei em Nápoles, Itália); (2) Isolamento de microrganismos resistentes ao metal pesado; (3) Identificação de isolados microbianos; (4) Caracterização fenotípica dos isolados. As metodologias descritas neste trabalho podem ser geralmente aplicadas também para o isolamento de microrganismos de outros ambientes extremos.

Introduction

Os ambientes extremos do nosso planeta são excelentes fontes de microrganismos capazes de tolerar condições severas (ou seja, temperatura, pH, salinidade, pressão e metais pesados)1,2, sendo Islândia, Itália, EUA, Nova Zelândia, Japão, África Central e Índia, as áreas vulcânicas mais reconhecidas e estudadas 3,4,5,6,7,8,9 . Os termófilos evoluíram em ambientes severos em uma faixa de temperaturas de 45 °C a 80 °C 10,11,12. Os microrganismos termofílicos, pertencentes aos reinos arqueais ou bacterianos, são um reservatório para o estudo da biodiversidade, filogênese e produção de biomoléculas exclusivas para aplicações industriais 13,14,15,16. De fato, nas últimas décadas, a contínua demanda industrial no mercado global tem incentivado a exploração de extremófilos e termozymes para suas aplicações diversificadas em diversos campos biotecnológicos 17,18,19.

As fontes termais, onde os organismos vivem em consórcios, são ricas fontes de biodiversidade, representando assim um habitat atraente para estudar a ecologia microbiana20,21. Além disso, essas áreas ricas em metais vulcânicos são comumente colonizadas por microrganismos que evoluíram sistemas de tolerância para sobreviver e se adaptar à presença de metais pesados22,23 e, portanto, estão ativamente envolvidos em seus ciclos biogeoquímicos. Atualmente, metais pesados são considerados poluentes prioritários para os seres humanos e para o meio ambiente. Os microrganismos resistentes ao metal pesado são capazes de solubilizar e precipitar metais transformando-os e remodelando seus ecossistemas24,25. A compreensão dos mecanismos moleculares da resistência ao metal pesado é um tema quente para a urgência de desenvolver novas abordagens verdes 26,27,28. Nesse contexto, a descoberta de novas bactérias tolerantes representa o ponto de partida para o desenvolvimento de novas estratégias de bioremediação ambiental24,29. Ao acompanhar os esforços para explorar ambientes hidrotérmicos através de procedimentos microbiológicos e aumentar o conhecimento sobre o papel dos genes que sustentam a tolerância ao metal pesado, foi realizada uma triagem microbiana na área de primavera quente de Campi Flegrei, na Itália. Este ambiente rico em metais pesados mostra uma poderosa atividade hidrotérmica, fumarole e piscinas de ebulição, variável em pH e temperatura em dependência de sazonalidade, chuvas e movimentos geológicos subterrâneos30. Nessa perspectiva, descrevemos uma maneira fácil de aplicar e eficaz de isolar bactérias resistentes a metais pesados, por exemplo, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (nomeado como isolado 1) e Alicyclobacillus mali FL1832 (nomeado como isolado 2) da área de Pisciarelli de Campi Flegrei.

Protocol

1. Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos Escolha o local para amostragem usando como critério locais com temperatura e pH desejados. Meça os parâmetros físicos através de uma sonda termopar digital, inserindo-a nas piscinas ou lamas selecionadas. Coletar 20 g de amostras de solos (neste caso, de lama no sítio hidrotérmico de Pisciarelli Solfatara), recolhendo-os com uma colher esterilizada. Pegue pelo menos duas amostras para cada local escolhido. Coloq…

Representative Results

Local de amostragemEste protocolo ilustra um método para o isolamento de bactérias resistentes a metais pesados de uma fonte termal. Neste estudo, a área de Pisciarelli, um ambiente geotérmico ácido-sulfísico, foi utilizada como local de amostragem (Figura 1). Este ecossistema é caracterizado pelo fluxo de fluidos sulfúricos agressivos derivados de atividades vulcânicas. Foi demonstrado que as comunidades microbianas em sistemas geotérmicos ác…

Discussion

As fontes termais contêm uma diversidade inexplorada de microbiomas com capacidades metabólicas igualmente diversas12. O desenvolvimento de estratégias para o isolamento de microrganismos que possam converter eficientemente metais pesados em compostos menos tóxicos10 representa uma área de pesquisa de crescente interesse em todo o mundo. Este artigo tem como objetivo descrever uma abordagem simplificada para a triagem e isolamento de micróbios com a capacidade de resi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 e pela GoodbyWaste: Obtaingood produtos-exploram por produtos-reduzir resíduos, MIUR 2017-JTNK78.006, Itália. Agradecemos ao Dr. Monica Piochi e à Dra.

Materials

Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
  2. Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
  3. Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
  4. Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
  5. Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
  6. Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
  7. Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
  8. Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
  9. Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
  10. Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
  11. Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
  12. Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
  13. Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
  14. Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
  16. Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
  17. Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
  18. Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
  19. Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
  20. Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
  21. He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
  22. Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
  23. Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
  24. Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
  25. Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
  26. Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
  27. Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
  28. Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
  29. Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
  30. Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
  31. Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
  32. Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
  33. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
  34. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  35. Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
  36. Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
  37. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
  38. Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
  39. Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
  40. Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
  41. Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
  42. Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).

Tags

BioprospectingExtremophilic MicroorganismsEnvironmental PollutionHeavy Metal ResistanceBiosensingBioremediationGeothermal SpringsLuria-Bertani MediumPHTemperatureGrowth ProfileBacterial Lysis Buffer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image