Bioprospectie van extremofiele micro-organismen om milieuvervuiling aan te pakken
Summary
De isolatie van zware metaalresistente microben uit geothermische bronnen is een hot topic voor de ontwikkeling van bioremediatie en milieumonitoring biosystemen. Deze studie biedt een methodologische benadering voor het isoleren en identificeren van zware metaaltolerante bacteriën uit warmwaterbronnen.
Abstract
Geothermische bronnen zijn rijk aan verschillende metaalionen vanwege de interactie tussen gesteente en water die plaatsvindt in de diepe watervoerende laag. Bovendien, als gevolg van seizoensgebonden variatie in pH en temperatuur, wordt fluctuatie in elementsamenstelling periodiek waargenomen in deze extreme omgevingen, waardoor de microbiële gemeenschappen in het milieu worden beïnvloed. Extremofiele micro-organismen die gedijen in vulkanische thermische ventilatieopeningen hebben resistentiemechanismen ontwikkeld om verschillende metaalionen in het milieu te verwerken, waardoor ze deelnemen aan complexe biogeochemische cycli van metalen. Bovendien hebben extremofielen en hun producten een uitgebreide voet aan de grond gekregen in de markt, en dit geldt vooral voor hun enzymen. In deze context is hun karakterisering functioneel voor de ontwikkeling van biosystemen en bioprocessen voor milieumonitoring en bioremediatie. Tot op heden vormen de isolatie en teelt onder laboratoriumomstandigheden van extremofiele micro-organismen nog steeds een knelpunt voor het volledig benutten van hun biotechnologisch potentieel. Dit werk beschrijft een gestroomlijnd protocol voor de isolatie van thermofiele micro-organismen uit warmwaterbronnen, evenals hun genotypische en fenotypische identificatie door middel van de volgende stappen: (1) Bemonstering van micro-organismen van geothermische sites (“Pisciarelli”, een vulkanisch gebied van Campi Flegrei in Napels, Italië); (2) Isolatie van zware metaalbestendige micro-organismen; (3) Identificatie van microbiële isolaten; (4) Fenotypische karakterisering van de isolaten. De methodologieën die in dit werk worden beschreven, kunnen in het algemeen ook worden toegepast voor de isolatie van micro-organismen uit andere extreme omgevingen.
Introduction
De extreme omgevingen op onze planeet zijn uitstekende bronnen van micro-organismen die in staat zijn om zware omstandigheden te verdragen (d.w.z. temperatuur, pH, zoutgehalte, druk en zware metalen)1,2, zijnde IJsland, Italië, de VS, Nieuw-Zeeland, Japan, Centraal-Afrika en India, de best erkende en bestudeerde vulkanische gebieden 3,4,5,6,7,8,9 . Thermofielen zijn geëvolueerd in ruwe omgevingen in een temperatuurbereik van 45 °C tot 80 °C 10,11,12. Thermofiele micro-organismen, die behoren tot de archaeale of bacteriële koninkrijken, zijn een reservoir voor de studie van biodiversiteit, fylogenese en de productie van exclusieve biomoleculen voor industriële toepassingen 13,14,15,16. In de afgelopen decennia heeft de voortdurende industriële vraag op de wereldmarkt de exploitatie van extremofielen en thermozymen voor hun gediversifieerde toepassingen op verschillende biotechnologische gebieden aangemoedigd 17,18,19.
Warmwaterbronnen, waar organismen in consortia leven, zijn rijke bronnen van biodiversiteit en vormen daarmee een aantrekkelijke habitat om microbiële ecologie tebestuderen 20,21. Bovendien worden deze vulkanische metaalrijke gebieden vaak gekoloniseerd door micro-organismen die tolerantiesystemen hebben ontwikkeld om te overleven en zich aan te passen aan de aanwezigheid van zware metalen22,23 en daarom actief betrokken zijn bij hun biogeochemische cycli. Tegenwoordig worden zware metalen beschouwd als prioritaire verontreinigende stoffen voor mens en milieu. De zware metaalbestendige micro-organismen zijn in staat om metalen op te lossen en neer te slaan door ze te transformeren en hun ecosystemen te hervormen24,25. Het begrip van de moleculaire mechanismen van resistentie tegen zware metalen is een hot topic voor de urgentie om nieuwe groene benaderingen te ontwikkelen 26,27,28. In deze context vormt de ontdekking van nieuwe tolerante bacteriën het startpunt voor het ontwikkelen van nieuwe strategieën voor bioremediatie in het milieu24,29. Ter begeleiding van de inspanningen om hydrothermale omgevingen te verkennen door middel van microbiologische procedures en de kennis te vergroten over de rol van het gen of de genen die ten grondslag liggen aan de tolerantie voor zware metalen, werd een microbiële screening uitgevoerd in het warmwaterbrongebied van Campi Flegrei in Italië. Deze zware metaalrijke omgeving vertoont een krachtige hydrothermale activiteit, fumarole en kokende zwembaden, variabel in pH en temperatuur in afhankelijkheid van seizoensgebondenheid, regenval en ondergrondse geologische bewegingen30. In dit perspectief beschrijven we een eenvoudig aan te brengen en effectieve manier om bacteriën te isoleren die resistent zijn tegen zware metalen, bijvoorbeeld Geobacillus stearothermophilus GF1631 (genoemd als isolaat 1) en Alicyclobacillus mali FL1832 (genoemd als isolaat 2) uit Pisciarelli gebied van Campi Flegrei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Warmwaterbronnen bevatten een onaangeboorde diversiteit aan microbiomen met even uiteenlopende metabolische capaciteiten12. De ontwikkeling van strategieën voor de isolatie van micro-organismen die zware metalen efficiënt kunnen omzetten in minder toxische verbindingen10 vertegenwoordigt een onderzoeksgebied van groeiende interesse wereldwijd. Dit artikel heeft tot doel een gestroomlijnde aanpak te beschrijven voor de screening en isolatie van microben met het vermogen om…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 en door GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italië. Wij danken Dr. Monica Piochi en Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italië) voor de identificatie en karakterisering van geothermische site.
Materials
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A9393 | |
| Aura Mini | bio air s.c.r.l. | Biological hood | |
| Bacitracin | Sigma Aldrich | B0125 | |
| Cadmium chloride | Sigma Aldrich | 202908 | |
| Chloramphenicol | Sigma Aldrich | C0378 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850 | |
| Cobalt chloride | Sigma Aldrich | C8661 | |
| Copper chloride | Sigma Aldrich | 224332 | |
| Erythromycin | Sigma Aldrich | E5389 | |
| Exernal Service | DSMZ | Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH | |
| Genomic DNA Purification Kit | Thermo Scientific | #K0721 | |
| Kanamycin sulphate | Sigma Aldrich | 60615 | |
| MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE4000 | |
| Mercury chloride | Sigma Aldrich | 215465 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| Nickel chloride | Sigma Aldrich | 654507 | |
| Orion Star A221 Portable pH Meter | Thermo Scientific | STARA2218 | |
| Sodium (meta) arsenite | Sigma Aldrich | S7400 | |
| Sodium arsenate dibasic heptahydrate | Sigma Aldrich | A6756 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Streptomycin | Sigma Aldrich | S6501 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 87128 | |
| Tryptone BioChemica | Applichem Panreac | A1553 | |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | PHR1732 | |
| Yeast extract for molecular biology | Applichem Panreac | A3732 |
References
- Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
- Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
- Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
- Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
- Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
- Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
- Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
- Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
- Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
- Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
- Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
- Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
- Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
- Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
- Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
- Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. Biochemistry. 50 (31), 6607-6621 (2011).
- Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
- Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
- Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
- Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
- He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
- Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
- Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
- Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
- Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
- Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
- Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
- Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
- Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
- Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
- Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
- Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
- Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
- Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
- Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
- Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
- Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
- Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
- Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
- Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).
