Parazitik bitki-konakçı etkileşimlerini analiz etmek için mikro-BT taramasından yararlanma

Yüksek çözünürlüklü röntgen mikrobilgisayarlı tomografi (mikro-BT), bir numunenin çoklu radyografilerinin (projeksiyonlarının) farklı görüş açılarından kaydedildiği ve daha sonra numunenin sanal bir rekonstrüksiyonunu sağlamak için kullanıldığı bir görüntüleme yöntemidir¹. Bu sanal nesne daha sonra analiz edilebilir, manipüle edilebilir ve bölümlere ayrılabilir, böylece üç boyutlu^2’de tahribatsız keşif yapılabilir. Başlangıçta tıbbi analizler ve daha sonra endüstriyel uygulamalar için tasarlanan mikro-BT, invaziv prosedürlere gerek kalmadan iç organları ve dokuları görselleştirme avantajı da sunar³. Diğer görüntüleme biçimleri gibi, mikro-BT de görüş alanı ve piksel boyutu arasında bir denge ile çalışır, bu da büyük örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesinin neredeyse ulaşılamaz olduğu anlamına gelir⁴. Yüksek enerjili X-ışını kaynaklarının (yani senkrotron) ve ikincil optik büyütmenin kullanımındaki ilerlemeler sürekli olarak yapılmakta ve en küçük çözünürlüğün 100 nm ^5,6’nın altına ulaşmasına izin verilmektedir. Bununla birlikte, büyük numuneler için daha uzun tarama süreleri gereklidir, bu da tarayıcı içindeki numune hareketi veya deformasyonu nedeniyle artefakt olasılığını artırır. Ayrıca, mikro-BT genellikle numune içindeki doğal yoğunluk değişimleri ve numunenin X-ışınları ile nasıl etkileşime girdiği ile sınırlıdır. Daha yoğun numunelere nüfuz etmek için daha yüksek bir X-ışını dozu en iyisi olsa da, numune ile çevresindeki ortam⁷ içindeki ve arasındaki yoğunluk değişikliklerini yakalamada daha az etkilidir. Öte yandan, daha düşük bir X-ışını dozu daha az penetrasyon gücü sunar ve genellikle daha uzun tarama süreleri gerektirir, ancak yoğunluk algılamada daha fazla hassasiyet gerektirir⁷.

Bu kısıtlamalar, çoğu bitki dokusunun düşük X-ışını emilimine sahip hafif (yoğun olmayan) dokudan oluştuğu göz önüne alındığında, bitki bilimleri için mikrotomografi kullanımını uzun zamandır engellemiştir⁸. Mikro-BT’nin ilk uygulamaları, toprak matrisi ^9,10 içindeki kök ağlarının haritalandırılmasına odaklanmıştır. Daha sonra, ahşap gibi doku yoğunluğunda daha önemli farklılıklar gösteren bitki yapıları araştırılmaya başlandı. Bu, ksilem işlevselliğinin 11,12, karmaşık doku organizasyonlarının gelişiminin 13,14 ve bitkiler arasındaki etkileşimlerin^{araştırılmasına} izin vermiştir 15,16,17. Yumuşak ve homojen doku analizi, bitki örneklerinin mikro-BT taraması için preparatlarda artık standart prosedür olan kontrast maddeler nedeniyle yaygınlaşmaktadır. Bununla birlikte, kontrast tanıtımı protokolleri, numune hacmine, yapısal özelliklere ve kullanılan çözeltinin türüne bağlı olarak farklı sonuçlara sahip olabilir⁸. İdeal olarak, kontrast madde farklı dokular arasındaki ayrımı arttırmalı, doku/organ işlevselliğinin değerlendirilmesini sağlamalı ve/veya bir doku hakkında biyokimyasal bilgi sağlamalıdır¹⁸. Bu nedenle, taramadan önce yeterli numune tedavisi, hazırlanması ve montajı, herhangi bir mikro-BT analizi için çok önemli hale gelir.

Parazitik bitki haustoriumunun mikro-BT’si
Parazitik çiçekli bitkiler, haustorium¹⁹ olarak bilinen bir organ ile karakterize edilen anjiyospermlerin ayrı bir fonksiyonel grubunu temsil eder. Modifiye edilmiş bir kök ve bir kök arasındaki gelişimsel bir melez olan bu çok hücreli organ, konakçının bağlanmasına, nüfuz etmesine ve bir parazit²⁰ ile temasına etki eder. Bu nedenle, haustoriumun “bitkiler arasındaki parazitizm fikrini somutlaştırdığı”²¹ düşünülmektedir. Bu organın gelişiminin, yapısının ve işleyişinin ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, parazitik bitki ekolojisi, evrimi ve yönetimi çalışmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte, parazitik bitkilerin genel karmaşıklığı ve yüksek oranda değiştirilmiş yapısı ve haustoria genellikle ayrıntılı analiz ve karşılaştırmayı engellemektedir. Haustorium bağlantıları da genellikle geniştir ve doku ve hücre dağılımında homojen değildir (Şekil 1). Bu bağlamda, küçük doku parçaları ile çalışmak daha kolay manipülasyon ve daha yüksek çözünürlük sağlarken, parazitik bitki haustorium gibi karmaşık yapıların üç boyutlu mimarisi hakkında hatalı sonuçlara yol açabilir.

Çoğu parazitik bitki türü için haustorium anatomisi ve ultrayapısı hakkında geniş bir literatür olmasına rağmen, parazit ve konakçı dokular arasındaki üç boyutlu organizasyon ve mekansal ilişki hala yeterince araştırılmamıştır¹⁷. Masumoto ve ^ark.22 tarafından yapılan yakın tarihli bir çalışmada, 300’den fazla seri yarı ince mikrotom bölümü görüntülendi ve iki parazit türünün haustoriumunu temsil eden üç boyutlu bir sanal nesneye yeniden yapılandırıldı. Bu yöntemin mükemmel ayrıntı seviyesi, haustoriumun hücresel ve anatomik 3-D yapısı hakkında benzeri görülmemiş bilgiler sağlar. Bununla birlikte, böyle zaman alıcı bir teknik, daha kapsamlı haustorium bağlantılarına sahip parazitlerde benzer bir analizi yasaklayacaktır. Mikro-BT kullanımı, parazitik bitkilerin karmaşık ve genellikle hacimli haustorialarının üç boyutlu analizi için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıntılı anatomik kesitleme ve mikroskopi analizlerinin diğer tamamlayıcı formlarının yerine geçmese de^17,23, özellikle büyük numuneler için mikro-BT taraması yoluyla elde edilen sonuçlar, daha sonra konfokal ve elektron mikroskobu gibi diğer araçlar kullanılarak analiz edilebilen veya yüksek çözünürlüklü mikro-BT sistemleriyle yeniden analiz edilebilen daha küçük segmentlerin alt örneklemesini yönlendirmek için bir rehber görevi görebilir.

Şekil 1: Bu protokolde kullanılan farklı fonksiyonel gruplara ait paraziter bitkiler. Euphytoid parazit Pyrularia pubera (A), endoparazit Viscum minimum (B) yeşil meyveler (kesikli siyah daire), parazitik asma Cuscuta americana (C), ökse otu Struthanthus martianus (D), zorunlu kök paraziti Scybalium fungiforme (E). Konakçı kökün (Hr) veya gövdenin (Hs) segmentleri, parazit haustoriuma (P) kontrast uygulanmasını kolaylaştırır. Numunede parazit ana kökü/gövdesinin (okların) varlığı, haustorium damar organizasyonunun analizine olanak sağlar. Dikdörtgenler, analiz için kullanılan numunenin segmentlerini gösterir. Ölçek çubukları = 2 cm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Mikro-BT, bitki bilimlerinde giderek daha popüler bir teknik haline geldikçe, örnek tarama, üç boyutlu rekonstrüksiyon, segmentasyon ve analiz ^3,10,24 ile ilgili kılavuzlar^, protokoller ve literatür bulunmaktadır. Bu nedenle, bu adımlar burada tartışılmayacaktır. Herhangi bir hayal etme tekniğinde olduğu gibi, numunelerin uygun şekilde işlenmesi ve montajı, çoğu zaman göz ardı edilen bir prosedür olmasına rağmen, temel bir prosedürdür. Bu nedenle, bu protokol mikro-BT taraması için haustorium örneklerinin hazırlanmasına odaklanmaktadır. Daha spesifik olarak, bu protokol, haustoriumdaki farklı dokuların ve hücre tiplerinin görselleştirilmesini iyileştirmek, konakçı kök / kök içindeki parazitik dokunun tespitini kolaylaştırmak ve parazit-konakçı vasküler bağlantılarını üç boyutlu olarak analiz etmek için haustoryum örneklerine kontrast maddeler sokmak için iki yaklaşımı açıklamaktadır. Burada açıklanan preparatlar, diğer bitki yapılarının analizine de uyarlanabilir.

Burada açıklanan protokolün rahatlığını daha iyi göstermek için beş tür kullanılmıştır. Her tür, parazitik çiçekli bitkilerin beş fonksiyonel grubundan birini temsil eder, böylece her grubun işlevselliği ile ilgili belirli noktaları ele alır. Pyrularia pubera (Santalaceae), toprakta çimlenen ve paraziti konakçılarının köklerine bağlayan çoklu haustoria oluşturan öfitoid parazitleri temsil etmek üzere seçildi²⁵. Bu bitkiler tarafından yaratılan haustoria genellikle zayıftır ve konakçı^26’dan kolayca ayrılır (Şekil 1A), bu nedenle daha hassas bir işleme süreci gerektirir. Endoparazitler burada Viscum minimum (Viscaceae) ile temsil edilir. Bu fonksiyonel gruptaki türler sadece kısa süreler için konakçılarının vücudunun dışında görülebilir (Şekil 1B) ve yaşam döngülerinin çoğunu konakçı dokuların içine gömülü hücrelerin önemli ölçüde azalmış ve miselli benzeri iplikçikleri olarak yaşarlar²⁵. Üçüncü bir fonksiyonel grup, zeminde çimlenen, ancak konakçı bitkilerin gövdelerine bağlanan çoklu haustorialara dayanan sadece ilkel kökler oluşturan parazitik asmalardan oluşur²⁵ (Şekil 1C). Burada, bu fonksiyonel grup Cuscuta americana (Convolvulaceae) ile temsil edilmektedir. Parazitik asmaların aksine, ökse otu doğrudan konakçı bitkilerinin dalları üzerinde çimlenir ve çoklu veya yalnız haustoria²⁵ geliştirir. Bu fonksiyonel grubu göstermek için seçilen tür, konakçı dal ile çeşitli bağlantılar oluşturan Struthanthus martianus’tur (Loranthaceae). Mikro-BT ve ışık mikroskobu kombinasyonu kullanılarak yalnız ökse otu haustoria’nın analizi Teixeira-Costa &; Ceccantini^17’de bulunabilir. Son olarak, zorunlu kök parazitleri, zeminde çimlenen ve en erken büyüme aşamalarından^25’ten itibaren tamamen bağımlı oldukları konakçı bitkilerin köklerine nüfuz eden türlerden oluşur. Bu bitkiler burada büyük yumru benzeri haustoria üreten Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) ile temsil edilmektedir (Şekil 1E).

Bu protokolde kullanılan tüm bitki örnekleri% 70 formalin asetik asit alkolüne (FAA 70) sabitlenmiştir. Örnekleme üzerine sabitleme, özellikle daha sonraki anatomik analizlere ihtiyaç duyulduğunda, bitki dokularını korumak için çok önemlidir. Parazitik bitki haustorium durumunda, fiksasyon da önemlidir, çünkü bu organ genellikle öncelikle odunlaşmamış parankim hücrelerinden oluşur²⁰. Fiksatif çözeltilerin hazırlanması da dahil olmak üzere bitki dokusu fiksasyonu için ayrıntılı protokoller başka bir yerde bulunabilir²⁷. Öte yandan, fiksatifler az ya da çok bir dereceye kadar, bir numunenin fiziksel ve kimyasal özelliklerinde değişikliklere neden olabilir ve bu da numuneyi spesifik biyomekanik ve histokimyasal analizler için uygun hale getiremez. Böylece, taze numuneler, yani hazırlıktan hemen önce toplanan sabitlenmemiş malzeme de bu protokolle kullanılabilir. Yeni numunelerin nasıl işleneceğine ilişkin ayrıntılar ve sabitlenmiş malzeme için sorun giderme önerileri tartışma bölümünde verilmiştir.