Использование микро-КТ-сканирования для анализа паразитических взаимодействий между растением и хозяином

Рентгеновская микрокомпьютерная томография высокого разрешения (микро-КТ) представляет собой метод визуализации, при котором несколько рентгенограмм (проекций) образца записываются под разными углами обзора и в дальнейшем используются для обеспечения виртуальной реконструкции образца¹. Затем этот виртуальный объект можно анализировать, манипулировать и сегментировать, что позволяет проводить неразрушающее исследование в трех измерениях². Первоначально разработанная для медицинских анализов, а затем для промышленного применения, микро-КТ также предлагает преимущество визуализации внутренних органов и тканей без необходимости инвазивных процедур³. Как и другие формы визуализации, микро-КТ работает с компромиссом между полем зрения и размером пикселя, что означает, что визуализация больших образцов с высоким разрешением практически недостижима⁴. Постоянно делаются успехи в использовании высокоэнергетических источников рентгеновского излучения (например, синхротрона) и вторичного оптического увеличения, что позволяет наименьшему разрешению достигать менее 100 нм ^5,6. Тем не менее, для больших образцов требуется более длительное время сканирования, что увеличивает вероятность появления артефактов из-за движения или деформации образца внутри сканера. Кроме того, микро-КТ обычно ограничена естественными изменениями плотности в образце и тем, как образец взаимодействует с рентгеновскими лучами. В то время как более высокая доза рентгеновского излучения лучше всего подходит для проникновения в более плотные образцы, она менее эффективна для улавливания изменений плотности внутри и между образцом и окружающей его средой⁷. С другой стороны, меньшая доза рентгеновского излучения обеспечивает меньшую проникающую способность и часто требует более длительного времени сканирования, но большей чувствительности при обнаружении плотности⁷.

Эти ограничения долгое время препятствовали использованию микротомографии в науках о растениях, учитывая, что большинство растительных тканей состоят из легкой (неплотной) ткани с низким поглощением рентгеновского излучения⁸. Первые применения микро-КТ были сосредоточены на картировании корневых сетей в почвенной матрице ^9,10. Позже стали исследоваться растительные структуры с более значительными различиями в плотности тканей, такие как древесина. Это позволило исследовать функциональность ксилемы 11,12, развитие сложных тканевых организаций^13,14 и взаимодействия между растениями^15,16,17. Анализ мягких и однородных тканей получает широкое распространение благодаря контрастным веществам, которые в настоящее время являются стандартной процедурой при подготовке к микро-КТ-сканированию образцов растений. Однако протоколы введения контраста могут иметь разные результаты в зависимости от объема образца, структурных свойств и типа используемого раствора⁸. В идеале контрастное вещество должно усиливать различие между различными тканями, позволять оценивать функциональность ткани/органа и/или предоставлять биохимическую информацию о ткани¹⁸. Таким образом, адекватная обработка, подготовка и монтаж образца перед сканированием приобретают решающее значение для любого микро-КТ-анализа.

Микро-КТ паразитического растения гаустория
Паразитические цветковые растения представляют собой отдельную функциональную группу покрытосеменных растений, характеризующихся органом, известным как гаусторий¹⁹. Этот многоклеточный орган, являющийся гибридом развития между модифицированным стеблем и корнем, воздействует на прикрепление, проникновение и контакт паразита²⁰ с хозяином. По этой причине считается, что гаусторий «воплощает саму идею паразитизма среди растений»²¹. Детальное понимание развития, структуры и функционирования этого органа имеет решающее значение для изучения экологии, эволюции и управления паразитическими растениями. Тем не менее, общая сложность паразитических растений и сильно измененная структура и гаустория часто препятствуют детальному анализу и сравнению. Гаусторийные связи также обычно обширны и неоднородны по распределению тканей и клеток (рис. 1). В этом контексте, хотя работа с небольшими фрагментами тканей позволяет легче манипулировать и иметь более высокое разрешение, это может привести к ошибочным выводам о трехмерной архитектуре сложных структур, таких как паразитический гаусторий растений.

Несмотря на то, что существует обширная литература по анатомии и ультраструктуре гаустория для большинства видов растений-паразитов, трехмерная организация и пространственные отношения между тканями паразита и хозяина остаются плохо изученными¹⁷. В недавней работе Masumoto et ^al.22 более 300 серийных полутонких срезов микротома были изображены и реконструированы в трехмерный виртуальный объект, представляющий гаусторий двух видов паразитов. Превосходный уровень детализации этого метода обеспечивает беспрецедентное понимание клеточной и анатомической 3D-структуры гаустория. Однако такой трудоемкий метод запретил бы аналогичный анализ у паразитов с более обширными гаусторийными связями. Использование микро-КТ становится отличным инструментом для трехмерного анализа сложных и часто громоздких гаусторий растений-паразитов. Несмотря на то, что результаты, полученные с помощью микро-КТ-сканирования, особенно для больших образцов, не заменяют подробное анатомическое срезирование и другие дополнительные формы микроскопического анализа^17,23, они также могут служить руководством для направления субвыборки более мелких сегментов, которые затем могут быть проанализированы с использованием других инструментов, таких как конфокальная и электронная микроскопия^, или повторно проанализированы с помощью систем микро-КТ с высоким разрешением.

Рисунок 1: Паразитические растения различных функциональных групп, используемые в этом протоколе. Эуфитоидный паразит Pyrularia pubera (A), эндопаразит Viscum minimum (B) с зелеными плодами (пунктирный черный круг), паразитическая лиана Cuscuta americana (C), омела Struthanthus martianus (D), облигатный корневой паразит Scybalium fungiforme (E). Сегменты корня хозяина (Hr) или стебля (Hs) облегчают применение контраста в гаустории паразита (P). Наличие в образце материнского корня/стебля паразита (стрелки) позволяет проанализировать организацию сосуда гаустория. Прямоугольниками обозначены сегменты образца, используемого для анализа. Масштабные линейки = 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

По мере того, как микро-КТ становится все более популярным методом в науках о растениях, существуют руководства, протоколы и литература, посвященные сканированию образцов, трехмерной реконструкции, сегментации и анализу ^3,10,24. Таким образом, эти шаги здесь обсуждаться не будут. Как и в случае с любой техникой воображения, надлежащая обработка и монтаж образцов являются фундаментальной, хотя и часто упускаемой из виду процедурой. По этой причине этот протокол фокусируется на подготовке образцов гаустория для микро-КТ-сканирования. Более конкретно, этот протокол описывает два подхода к введению контрастных веществ в образцы гаустория для улучшения визуализации различных тканей и типов клеток в гаустории, для облегчения обнаружения паразитарной ткани в корне / стебле хозяина и для анализа сосудистых связей паразит-хозяин в трех измерениях. Препараты, описанные здесь, также могут быть адаптированы для анализа других структур растений.

Пять видов были использованы, чтобы лучше проиллюстрировать удобство протокола, описанного здесь. Каждый вид представляет одну из пяти функциональных групп паразитических цветковых растений, тем самым обращаясь к конкретным моментам, связанным с функциональностью каждой группы. Pyrularia pubera (Santalaceae) была выбрана для представления эуфитоидных паразитов, которые прорастают в землю и образуют множественные гаустории, которые соединяют паразита с корнями его хозяев²⁵. Гаустории, создаваемые этими растениями, часто разрежены и легко отрываются от хозяина²⁶ (рис. 1А), что требует более деликатного процесса обращения. Эндопаразиты представлены здесь Viscum minimum (Viscaceae). Виды этой функциональной группы видны вне тела своих хозяев только в течение коротких периодов времени (рис. 1B) и живут большую часть своих жизненных циклов в виде значительно редуцированных и мицелиальноподобных нитей клеток, встроенных в ткани хозяина²⁵. Третья функциональная группа включает паразитические лианы, которые прорастают на земле, но образуют только рудиментарные корни, опираясь на множественные гаустории, которые прикрепляются к стеблям растений-хозяев²⁵ (рис. 1С). Здесь эта функциональная группа представлена Cuscuta americana (Convolvulaceae). В отличие от паразитических лиан, омела прорастает непосредственно на ветвях растений-хозяев и развивает либо множественную, либо одиночную гаусторию²⁵. Видом, выбранным для иллюстрации этой функциональной группы, является Struthanthus martianus (Loranthaceae), который образует различные связи с ветвью хозяина (рис. 1D). Анализ одиночной гаустории омелы с использованием комбинации микро-КТ и световой микроскопии можно найти в Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Наконец, облигатные корневые паразиты включают виды, которые прорастают на земле и проникают в корни растений-хозяев, от которых они полностью зависят с самых ранних стадий роста²⁵. Эти растения представлены здесь Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), которые производят крупные клубневидные гаустории (рис. 1E).

Все образцы растений, использованные в этом протоколе, были зафиксированы в 70% спирте формалиновой уксусной кислоты (FAA 70). Фиксация при отборе проб имеет решающее значение для сохранения растительных тканей, особенно если необходимы последующие анатомические анализы. В случае паразитического гаустория растений фиксация также необходима, так как этот орган часто в основном состоит из неодревесневших клеток паренхимы²⁰. Подробные протоколы фиксации растительной ткани, включая приготовление фиксирующих растворов, можно найти в другом месте²⁷. С другой стороны, в большей или меньшей степени фиксаторы могут вызывать изменения физических и химических свойств образца, делая его непригодным для конкретных биомеханических и гистохимических анализов. Таким образом, свежие образцы, т.е. нефиксированный материал, собранный непосредственно перед подготовкой, также могут быть использованы с этим протоколом. Подробная информация о том, как работать со свежими образцами, и предложения по устранению неполадок с фиксированным материалом приведены в разделе обсуждения.