מינוף סריקת מיקרו-CT לניתוח אינטראקציות טפיליות בין צמח למארח

טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה (micro-CT) היא שיטת הדמיה שבה צילומי רנטגן מרובים (הקרנות) של דגימה נרשמים מזוויות צפייה שונות ומשמשים מאוחר יותר כדי לספק שחזור וירטואלי של המדגם¹. לאחר מכן ניתן לנתח, לתפעל ולפלח אובייקט וירטואלי זה, המאפשר חקירה לא הרסנית בשלושה ממדים². מיקרו-CT, שתוכנן בתחילה עבור ניתוחים רפואיים ומאוחר יותר עבור יישומים תעשייתיים, מציע גם את היתרון של הדמיה של איברים פנימיים ורקמות ללא צורך בהליכים פולשניים³. כמו צורות אחרות של הדמיה, מיקרו-CT עובד עם פשרה בין שדה הראייה לגודל הפיקסל, מה שאומר שהדמיה ברזולוציה גבוהה של דגימות גדולות היא כמעט בלתי מושגת⁴. התקדמות בשימוש במקורות רנטגן עתירי אנרגיה (כלומר, סינכרוטרון) והגדלה אופטית משנית נעשים כל הזמן, ומאפשרים לרזולוציה הקטנה ביותר להגיע מתחת ל -100 ננומטר ^5,6. עם זאת, זמני סריקה ארוכים יותר נחוצים עבור דגימות גדולות, מה שמגדיל את הסיכוי לממצאים עקב תנועת הדגימה או עיוות בתוך הסורק. יתר על כן, מיקרו-CT מוגבל בדרך כלל על ידי שינויים בצפיפות הטבעית בתוך הדגימה וכיצד הדגימה מתקשרת עם קרני רנטגן. בעוד שמינון גבוה יותר של קרני רנטגן הוא הטוב ביותר לחדירה לדגימות צפופות יותר, הוא פחות יעיל בלכידת שינויים בצפיפות בתוך ובין הדגימה לבין המדיום הסובב אותה⁷. מצד שני, מינון רנטגן נמוך יותר מציע פחות כוח חדירה ולעתים קרובות דורש זמני סריקה ארוכים יותר אך רגישות רבה יותר בזיהוי צפיפות⁷.

הגבלות אלה הקשו זה מכבר על השימוש במיקרוטומוגרפיה למדעי הצמח, בהתחשב בכך שרוב רקמות הצמח מורכבות מרקמה קלה (לא צפופה) עם ספיגת רנטגן נמוכה⁸. היישומים הראשונים של מיקרו-CT התמקדו במיפוי רשתות שורשים בתוך מטריצת הקרקע ^9,10. מאוחר יותר, מבנים צמחיים עם הבדלים משמעותיים יותר בצפיפות הרקמות, כגון עץ, החלו להיחקר. זה איפשר חקירות של פונקציונליות xylem^11,12, פיתוח של ארגוני רקמות מורכבים 13,14, ואינטראקציות בין צמחים^15,16,17. ניתוח רקמות רכות והומוגניות הופך נפוץ בשל חומרי ניגוד, שהם כיום הליך סטנדרטי בהכנות לסריקת מיקרו-CT של דגימות צמחים. עם זאת, פרוטוקולים להצגת ניגודיות יכולים לקבל תוצאות שונות בהתאם לנפח הדגימה, המאפיינים המבניים וסוג התמיסה שבה נעשה שימוש⁸. באופן אידיאלי, חומר הניגוד צריך לשפר את ההבחנה בין רקמות שונות, לאפשר הערכת פונקציונליות רקמות/איברים, ו / או לספק מידע ביוכימי על רקמה¹⁸. לכן, טיפול מדגימה נאות, הכנה והרכבה לפני הסריקה הופכים קריטיים לכל ניתוח מיקרו-CT.

מיקרו-CT של הצמח הטפילי haustorium
צמחים פורחים טפיליים מייצגים קבוצה פונקציונלית מובחנת של אנגיוספרמים המאופיינת על ידי איבר המכונה haustorium¹⁹. איבר רב-תאי זה, הכלאה התפתחותית בין גבעול שעבר שינוי לבין שורש, פועל על התקשרות, חדירה ומגע של הפונדקאי על ידי טפיל²⁰. מסיבה זו, האוסטוריום נחשב כ”מגלם את עצם הרעיון של טפילות בקרב צמחים”²¹. הבנה מפורטת של התפתחותו, מבנהו ותפקודו של איבר זה חיונית לאקולוגיה של צמחים טפיליים, אבולוציה ומחקרי ניהול. אף על פי כן, המורכבות הכוללת של צמחים טפיליים והמבנה והאוסטוריה המשופרים מעכבים לעתים קרובות ניתוח מפורט והשוואה. קשרי האוסטוריום הם גם בדרך כלל נרחבים ואינם הומוגניים בהתפלגות הרקמות והתאים (איור 1). בהקשר זה, בעוד שעבודה עם שברי רקמות קטנות מאפשרת מניפולציה קלה יותר ורזולוציה גבוהה יותר, היא עלולה להוביל למסקנות שגויות לגבי הארכיטקטורה התלת-ממדית של מבנים מורכבים, כגון האוסטוריום הצמחי הטפילי.

אף על פי שקיימת ספרות ענפה על אנטומיה של האוסטרויום ומבנה העל עבור רוב מיני הצמחים הטפיליים, הארגון התלת-ממדי והקשר המרחבי בין טפיל לרקמות פונדקאי עדיין נחקרים בצורה גרועה¹⁷. בעבודה שנערכה לאחרונה על ידי Masumoto et ^al.22, יותר מ-300 קטעי מיקרוטום סדרתיים דקים למחצה צולמו ושוחזרו לאובייקט וירטואלי תלת-ממדי המייצג את האוסטוריום של שני מיני טפילים. רמת הפירוט המצוינת של שיטה זו מספקת תובנות חסרות תקדים על המבנה התלת-ממדי התאי והאנטומי של האוסטויום. עם זאת, טכניקה כזו הגוזלת זמן רב תאסור ניתוח דומה בטפילים עם קשרים נרחבים יותר של האוסטוריום. השימוש במיקרו-CT מתגלה ככלי מצוין לניתוח תלת-ממדי של צמחים טפיליים מורכבים ולעתים קרובות מגושמים. למרות שאינו מהווה תחליף לחתכים אנטומיים מפורטים וצורות משלימות אחרות של ניתוח מיקרוסקופיה^17,23, תוצאות המתקבלות באמצעות סריקת מיקרו-CT, במיוחד עבור דגימות גדולות, יכולות לשמש גם כמדריך לכוון את תת-הדגימה של מקטעים קטנים יותר, אשר לאחר מכן ניתן לנתח באמצעות כלים אחרים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי ואלקטרונים^, או לנתח מחדש עם מערכות מיקרו-CT ברזולוציה גבוהה.

איור 1: צמחים טפיליים מקבוצות פונקציונליות שונות שמשתמשים בהם בפרוטוקול הזה. טפיל Euphytoid Pyrularia pubera (A), endoparasite Viscum minimum (B) עם פירות ירוקים (עיגול שחור מקווקו), גפן טפילית Cuscuta americana (C), דבקון Struthanthus martianus (D), טפיל שורש מחייב Scybalium fungiforme (E). מקטעים של שורש הפונדקאי (Hr) או הגבעול (Hs) מאפשרים את יישום הניגוד לתוך הטפיל haustorium (P). הימצאות שורש אם/גבעול הטפיל (חיצים) בדגימה מאפשרת ניתוח של ארגון כלי האוסטוריום. מלבנים מציינים מקטעים של המדגם המשמשים לניתוח. פסי קנה מידה = 2 ס”מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ככל שמיקרו-CT הופך לטכניקה פופולרית יותר ויותר במדעי הצמח, ישנם מדריכים, פרוטוקולים וספרות העוסקים בסריקת דגימות, שחזור תלת מימדי, סגמנטציה וניתוח ^3,10,24. לפיכך, צעדים אלה לא יידונו כאן. כמו בכל טכניקת דמיון, טיפול מתאים והרכבה של דגימות הם בסיסיים, אם כי לעתים קרובות להיות הליך התעלמות. מסיבה זו, פרוטוקול זה מתמקד בהכנת דגימות haustorium עבור סריקת micro-CT. באופן ספציפי יותר, פרוטוקול זה מתאר שתי גישות להחדרת חומרי ניגוד לדגימות האוסטוריום כדי לשפר את ההדמיה של רקמות וסוגי תאים שונים בהאוסטוריום, להקל על זיהוי רקמות טפיליות בתוך השורש/גזע הפונדקאי, ולנתח קשרי כלי דם בין טפיל למארח בשלושה ממדים. ההכנות המתוארות כאן יכולות להיות מותאמות גם לניתוח של מבני צמחים אחרים.

חמישה מינים שימשו כדי להמחיש טוב יותר את הנוחות של הפרוטוקול המתואר כאן. כל מין מייצג אחת מחמש הקבוצות הפונקציונליות של צמחים פורחים טפיליים, ובכך מתייחס לנקודות ספציפיות הקשורות לפונקציונליות של כל קבוצה. Pyrularia pubera (Santalaceae) נבחר לייצג טפילים אופיטואידים, הנובטים באדמה ויוצרים מספר אוסטוריה המחברים את הטפיל לשורשי פונדקאיו²⁵ . האוסטוריה שנוצרת על-ידי הצמחים האלה היא לעתים קרובות רופפת ונקרעת בקלות מהפונדקאי²⁶ (איור 1A), ולכן דורשת תהליך טיפול עדין יותר. אנדופרזיטים מיוצגים כאן על ידי Viscum minimum (Viscaceae). מינים בקבוצה הפונקציונלית הזו נראים רק מחוץ לגוף המארחים שלהם לפרקי זמן קצרים (איור 1B), וחיים את רוב מחזורי החיים שלהם כגדילי תאים מופחתים ודמויי תפטיר שמוטבעים בתוך רקמות מארחות²⁵. קבוצה פונקציונלית שלישית כוללת גפנים טפיליות, שנובטות על הקרקע אך יוצרות שורשים בסיסיים בלבד, תוך הסתמכות על הוסטוריה מרובה שמתחברת לגבעולים של צמחים פונדקאים²⁵ (איור 1C). כאן, קבוצה פונקציונלית זו מיוצגת על ידי Cuscuta americana (Convolvulaceae). בניגוד לגפנים טפיליות, דבקונים נובטים ישירות על ענפי הצמחים המארחים שלהם ומפתחים אוסטוריה מרובה או בודדת²⁵. המין שנבחר כדי להמחיש את הקבוצה הפונקציונלית הזו הוא Struthanthus martianus (Loranthaceae), אשר יוצר קשרים שונים עם הענף המארח (איור 1D). ניתוח של דבקון בודד באמצעות שילוב של מיקרו-CT ומיקרוסקופ אור ניתן למצוא ב Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. לבסוף, טפילי שורש חייבים הם מינים הנובטים על הקרקע וחודרים לשורשי הצמחים המארחים, שבהם הם תלויים לחלוטין משלבי הצמיחה המוקדמים ביותר²⁵ . הצמחים האלה מיוצגים כאן על-ידי פטריות סקיבליום (Balanophoraceae), שמייצרות אוסטוריה גדולה דמוית פקעת (איור 1E).

כל דגימות הצמחים ששימשו בפרוטוקול זה תוקנו באלכוהול של 70% חומצה אצטית פורמלית (FAA 70). הקיבוע בעת הדגימה חיוני לשימור רקמות הצמח, במיוחד אם יש צורך בניתוחים אנטומיים עוקבים. במקרה של האוסטורימה צמחית טפילית, קיבוע הוא גם חיוני, כמו איבר זה מורכב לעתים קרובות בעיקר של תאי parenchyma non-lignified²⁰. פרוטוקולים מפורטים לקיבוע רקמות צמחים, כולל הכנת תמיסות קיבוע, ניתן למצוא במקום אחר²⁷. מצד שני, במידה רבה יותר או פחות, קיבועים יכולים לגרום לשינויים בתכונות הפיזיקליות והכימיות של הדגימה, מה שהופך אותה ללא מתאימה לניתוחים ביומכניים והיסטוכימיים ספציפיים. לכן, דגימות טריות, כלומר, חומר לא קבוע שנאסף מיד לפני ההכנה, יכול לשמש גם עם פרוטוקול זה. פרטים על אופן הטיפול בדוגמאות טריות והצעות לפתרון בעיות עבור חומר מקובע מופיעים בסעיף הדיון.