Tirer parti de la micro-tomodensitométrie pour analyser les interactions parasites-plantes et hôtes

La microtomodensitométrie à rayons X à haute résolution (micro-TDM) est une méthode d’imagerie dans laquelle plusieurs radiographies (projections) d’un échantillon sont enregistrées sous différents angles de vue et utilisées plus tard pour fournir une reconstruction virtuelle de l’échantillon¹. Cet objet virtuel peut ensuite être analysé, manipulé et segmenté, permettant une exploration non destructive en trois dimensions². Initialement conçu pour les analyses médicales et plus tard pour les applications industrielles, le micro-CT offre également l’avantage de visualiser les organes et tissus internes sans nécessiter de procédures invasives³. Comme d’autres formes d’imagerie, la micro-tomodensitométrie fonctionne avec un compromis entre le champ de vision et la taille des pixels, ce qui signifie que l’imagerie haute résolution de grands échantillons est presque inaccessible⁴. Des progrès dans l’utilisation de sources de rayons X à haute énergie (c.-à-d. synchrotron) et d’un grossissement optique secondaire sont constamment réalisés, permettant à la plus petite résolution d’atteindre moins de 100 nm ^5,6. Néanmoins, des temps de numérisation plus longs sont nécessaires pour les échantillons volumineux, ce qui augmente le risque d’artefacts en raison du mouvement ou de la déformation de l’échantillon à l’intérieur du scanner. De plus, la micro-TDM est généralement limitée par les variations naturelles de densité au sein de l’échantillon et par la façon dont l’échantillon interagit avec les rayons X. Bien qu’une dose de rayons X plus élevée soit préférable pour pénétrer dans des échantillons plus denses, elle est moins efficace pour capturer les variations de densité à l’intérieur et entre l’échantillon et son milieu environnant⁷. D’autre part, une dose de rayons X plus faible offre moins de puissance de pénétration et nécessite souvent des temps de balayage plus longs mais plus de sensibilité dans la détection de la densité⁷.

Ces restrictions ont longtemps entravé l’utilisation de la microtomographie pour les sciences végétales, étant donné que la plupart des tissus végétaux sont composés de tissus légers (non denses) à faible absorption des rayons X⁸. Les premières applications de la micro-CT ont été axées sur la cartographie des réseaux racinaires dans la matrice du sol ^9,10. Plus tard, des structures végétales présentant des différences plus significatives dans la densité des tissus, telles que le bois, ont commencé à être explorées. Cela a permis d’étudier la fonctionnalité du xylème 11,12, le développement d’organisations tissulaires complexes^13,14 et les interactions entre les plantes^15,16,17. L’analyse des tissus mous et homogènes se généralise en raison des agents de contraste, qui sont maintenant une procédure standard dans les préparations pour le micro-balayage CT d’échantillons de plantes. Cependant, les protocoles d’introduction du contraste peuvent avoir des résultats différents selon le volume de l’échantillon, les propriétés structurelles et le type de solution utilisée⁸. Idéalement, l’agent de contraste devrait améliorer la distinction entre les différents tissus, permettre l’évaluation de la fonctionnalité des tissus et des organes et/ou fournir des informations biochimiques sur un tissu¹⁸. Par conséquent, un traitement, une préparation et un montage adéquats de l’échantillon avant la numérisation deviennent cruciaux pour toute analyse micro-CT.

Micro-CT de la plante parasite haustorium
Les plantes parasites à fleurs représentent un groupe fonctionnel distinct d’angiospermes caractérisés par un organe connu sous le nom de haustorium¹⁹. Cet organe multicellulaire, hybride développemental entre une tige modifiée et une racine, agit sur l’attachement, la pénétration et le contact de l’hôte par un parasite²⁰. Pour cette raison, l’haustorium est considéré comme « incarnant l’idée même de parasitisme chez les plantes »²¹. Une compréhension détaillée du développement, de la structure et du fonctionnement de cet organe est cruciale pour les études sur l’écologie des plantes parasites, l’évolution et la gestion. Néanmoins, la complexité globale des plantes parasites et leur structure et haustoria fortement modifiées entravent souvent l’analyse détaillée et la comparaison. Les connexions haustorium sont également généralement étendues et non homogènes dans la distribution des tissus et des cellules (Figure 1). Dans ce contexte, bien que le travail avec de petits fragments de tissu permette une manipulation plus facile et une résolution plus élevée, il peut conduire à des conclusions erronées sur l’architecture tridimensionnelle de structures complexes, telles que la plante parasite haustorium.

Bien qu’il existe une vaste littérature sur l’anatomie et l’ultrastructure de l’haustorium pour la plupart des espèces végétales parasites, l’organisation tridimensionnelle et la relation spatiale entre le parasite et les tissus hôtes restent peu explorées¹⁷. Dans un travail récent de Masumoto et ^al.22, plus de 300 sections de microtomes semi-minces en série ont été imagées et reconstruites en un objet virtuel tridimensionnel représentant l’haustorium de deux espèces de parasites. L’excellent niveau de détail de cette méthode fournit des informations sans précédent sur la structure 3D cellulaire et anatomique de l’haustorium. Cependant, une technique aussi longue interdirait une analyse similaire chez les parasites ayant des connexions haustorium plus étendues. L’utilisation de la micro-CT apparaît comme un excellent outil pour l’analyse tridimensionnelle de haustoria complexes et souvent volumineuses de plantes parasites. Bien qu’ils ne remplacent pas le sectionnement anatomique détaillé et d’autres formes complémentaires d’analyses microscopiques^17,23, les résultats obtenus par micro-tomodensitométrie, en particulier pour les grands échantillons, peuvent également servir de guide pour diriger le sous-échantillonnage de segments plus petits, qui peuvent ensuite être analysés à l’aide d’autres outils, tels que la microscopie confocale et électronique^, ou réanalysés avec des systèmes de micro-tomodensitométrie à haute résolution.

Figure 1 : Plantes parasites de différents groupes fonctionnels utilisés dans ce protocole. Pyrularia pubera (A), endoparasite Viscum minimum (B) avec fruits verts (cercle noir pointillé), vigne parasite Cuscuta americana (C), gui Struthanthus martianus (D), parasite racinaire obligatoire Scybalium fungiforme (E). Les segments de la racine hôte (Hr) ou de la tige (Hs) facilitent l’application du contraste dans le parasite haustorium (P). La présence de racine/tige mère du parasite (flèches) dans l’échantillon permet d’analyser l’organisation des vaisseaux de l’haursorium. Les rectangles indiquent les segments de l’échantillon utilisé pour l’analyse. Barres d’échelle = 2 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Alors que la micro-TDM devient une technique de plus en plus populaire en sciences végétales, il existe des guides, des protocoles et de la littérature traitant de la numérisation d’échantillons, de la reconstruction tridimensionnelle, de la segmentation et de l’analyse ^3,10,24. Ainsi, ces étapes ne seront pas discutées ici. Comme pour toute technique d’imagination, le traitement et le montage appropriés des échantillons sont fondamentaux, bien qu’il s’agisse souvent d’une procédure négligée. Pour cette raison, ce protocole se concentre sur la préparation d’échantillons d’haustorium pour la micro-tomodensitométrie. Plus précisément, ce protocole décrit deux approches pour introduire des agents de contraste dans les échantillons d’haustorium afin d’améliorer la visualisation de différents tissus et types de cellules dans l’haustorium, de faciliter la détection de tissu parasite dans la racine / tige hôte et d’analyser les connexions vasculaires parasite-hôte en trois dimensions. Les préparations décrites ici peuvent également être adaptées à l’analyse d’autres structures végétales.

Cinq espèces ont été utilisées pour mieux illustrer la commodité du protocole décrit ici. Chaque espèce représente l’un des cinq groupes fonctionnels de plantes à fleurs parasites, abordant ainsi des points spécifiques liés à la fonctionnalité de chaque groupe. Pyrularia pubera (Santalaceae) a été choisi pour représenter les parasites euphytoïdes, qui germent dans le sol et forment de multiples haustoria qui relient le parasite aux racines de ses hôtes²⁵. Les haustoria créées par ces plantes sont souvent ténues et facilement arrachées de l’hôte²⁶ (Figure 1A), nécessitant ainsi un processus de manipulation plus délicat. Les endoparasites sont représentés ici par Viscum minimum (Viscaceae). Les espèces de ce groupe fonctionnel ne sont visibles à l’extérieur du corps de leurs hôtes que pendant de courtes périodes (Figure 1B) et vivent la plupart de leurs cycles de vie sous forme de brins de cellules significativement réduits et de type mycélial incorporés dans les tissus hôtes²⁵. Un troisième groupe fonctionnel comprend les vignes parasites, qui germent au sol mais ne forment que des racines rudimentaires, s’appuyant sur de multiples haustoria qui s’attachent aux tiges des plantes hôtes²⁵ (Figure 1C). Ici, ce groupe fonctionnel est représenté par Cuscuta americana (Convolvulaceae). Contrairement aux vignes parasites, les guis germent directement sur les branches de leurs plantes hôtes et développent des haustoria multiples ou solitaires²⁵. L’espèce choisie pour illustrer ce groupe fonctionnel est Struthanthus martianus (Loranthaceae), qui forme diverses connexions avec la branche hôte (Figure 1D). L’analyse de la haustoria de gui solitaire à l’aide d’une combinaison de micro-tomodensitométrie et de microscopie optique peut être trouvée dans Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Enfin, les parasites racinaires obligatoires comprennent les espèces qui germent sur le sol et pénètrent dans les racines des plantes hôtes, dont elles dépendent entièrement dès les premiers stades de croissance²⁵. Ces plantes sont représentées ici par Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), qui produit de grandes haustoria ressemblant à des tubercules (Figure 1E).

Tous les échantillons végétaux utilisés dans ce protocole ont été fixés dans un alcool d’acide acétique au formol à 70 % (FAA 70). La fixation lors de l’échantillonnage est cruciale pour la préservation des tissus végétaux, en particulier si des analyses anatomiques ultérieures sont nécessaires. Dans le cas de la plante parasite haustorium, la fixation est également essentielle, car cet organe est souvent principalement composé de cellules de parenchyme non lignifiées²⁰. Des protocoles détaillés pour la fixation des tissus végétaux, y compris la préparation de solutions fixatrices, peuvent être trouvés ailleurs²⁷. D’autre part, à un degré plus ou moins grand, les fixateurs peuvent provoquer des altérations des propriétés physiques et chimiques d’un échantillon, le rendant impropre à des analyses biomécaniques et histochimiques spécifiques. Ainsi, des échantillons frais, c’est-à-dire du matériel non fixé prélevé immédiatement avant la préparation, peuvent également être utilisés avec ce protocole. Des détails sur la façon de manipuler de nouveaux échantillons et des suggestions de dépannage pour le matériel fixe sont fournis dans la section de discussion.