Привлечение ученых сообщества для проведения неразрушающего генетического отбора редких популяций бабочек
Summary
Здесь мы представляем простой протокол для неинвазивного генетического отбора популяций бабочек на основе полевого сбора остаточного остатка яйцеклеток. Он может быть использован для подтверждения видовой идентичности и количественной оценки генетической изменчивости. Этот протокол может быть легко адаптирован к более широким группам для участия науки сообщества.
Abstract
Глобальное сокращение численности насекомых продолжает ускоряться. Эффективная генетическая выборка крайне необходима для углубления понимания многих таксонов и устранения существующих пробелов в знаниях. Этот протокол представляет собой продемонстрированный метод неразрушающего отбора проб редких бабочек для анализа популяционной генетической структуры или штрих-кодирования ДНК. Он использует хорион вылупившихся яйцеклеток бабочек, чтобы получить достаточно высокое количество и качество ДНК для успешного секвенирования генов для подтверждения идентичности вида и количественной оценки генетической изменчивости. Это может быть особенно полезно, когда другие методы отбора проб тканей непрактичны или недоступны. Хотя он разработан для чешуекрылых, он, тем не менее, может быть легко адаптирован для использования с другими видами насекомых. Он был специально разработан с простотой использования в качестве цели, чтобы помочь максимизировать широкое внедрение людьми с различным опытом и уровнем квалификации, такими как общинные ученые, специалисты по охране природы и студенты, а также для использования в больших географических районах для облегчения широкой выборки населения. Полученные данные могут помочь в принятии таксономических и листинговых решений, мерах по сохранению и управлению, а также в укреплении фундаментальных экологических исследований.
Introduction
Эффективная популяционная генетическая выборка редких, сокращающихся и/или перечисленных таксонов насекомых часто имеет решающее значение для информирования о мерах по сохранению и управлению. Смертельные или травматические методы отбора проб тканей обычно используются для многих генетических анализов. Однако эти методы нежелательны или не разрешены, поскольку они могут нанести вред уязвимым существующим группам населения или негативно повлиять на поведение и приспособленность. Различные нелетальные или неинвазивные методы отбора проб с участием тканей, таких как цельные ноги, усики или обрезания крыльев, личиночные эксувии или гемолимфа из защитных выделений и других продуктов, таких как фрасс, были пригодны для генетических исследований насекомых 1,2,3,4,4,5,6,7,8,9 . Общая осуществимость и применимость этих различных методов отбора проб тканей значительно различаются в зависимости от биологии, экологии, поведения, размера и редкости очагового организма, ситуации и людей, собирающих материал. Например, обрезки целых ног или придатков требуют временного захвата и осторожного обращения с несколькими особями соответствующего жизненного этапа, как правило, опытным персоналом. Аналогичным образом, тканевые источники, такие как личиночные эксувии или фрассы, вероятно, будут практичными только в том случае, если организмы находятся в неволе или временно содержатся в течение достаточного периода.
Для исследовательских вопросов, задаваемых на уровне популяции, таких как вопросы, касающиеся потенциальной таксономической дифференциации или генетической структуры, часто требуется выборка в более широком временном или географическом масштабе (т.е. региональном или континентальном). В результате некоторые неинвазивные источники тканей могут быть совершенно непрактичными или, по крайней мере, неэффективными для сбора в количестве. Кроме того, сбор проб в таких масштабах может оказаться материально-техническим или финансовым нецелесообразным или непомерно опасным для отдельных исследователей или даже небольших полевых групп. В то время как прямое участие ученых сообщества все чаще принимается исследовательским сообществом для решения многих из этих проблем и ускорения сбора больших данных, принятие было ограничено для исследований, включающих неразрушающий, неинвазивный или eDNA выборку 10,11,12.
Чтобы помочь преодолеть некоторые из этих потенциальных ограничений, мы продемонстрировали, что хорион из вылупившихся яйцеклеток бабочки может дать достаточно большое количество и качество ДНК для успешного секвенирования генов для подтверждения идентичности вида и количественной оценки генетической изменчивости. Впоследствии мы протестировали различные протоколы сбора с использованием этого метода13. Эта экспериментальная работа послужила основой для дальнейшего методологического уточнения. В этом документе подробно описывается итоговый простой, но всеобъемлющий пересмотренный протокол сбора данных на местах, развернутый для ученых сообщества и другого неэкспертного персонала. Этот протокол является частью анализа структуры популяции матовой эльфийской бабочки (Callophrys irus), чтобы помочь информировать о будущих действиях по сохранению и федеральном определении возможного включения в список в соответствии с Законом США об исчезающих видах. Хотя потенциально более трудоемкий, чем некоторые неинвазивные методы, отсутствие необходимого контакта с организмом и простота использования делают его потенциально жизнеспособной моделью, которая может быть применена к другим программам генетических исследований популяции, нацеленным на выбор как обычных насекомых, так и насекомых, вызывающих озабоченность по сохранению, которые оставляют остаточные остатки яичных обломков от недавно вылупившихся нимф или личинок. Язык протокола, представленный здесь, был специально разработан для бабочек в семействе Lycaenidae и для использования неспециалистами, определяемыми здесь как ученые сообщества или другие лица (например, биологи агентства, интерны) с ограниченным энтомологическим опытом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает полевой метод неразрушающего отбора проб редких бабочек для генетической структуры популяции или анализа штрихкодирования ДНК. Общие преимущества этого протокола специально разработаны, чтобы помочь максимизировать широкое внедрение людьми с различным опытом и уровнем квалификации, такими как ученые сообщества, практики сохранения и студенты. К ним относятся относительно низкая общая стоимость, простые в приобретении расходные материалы и оборудование, простой и доступный метод без многочисленных чрезмерно сложных шагов и простое развертывание в широкой географической области. Он также нацелен на остаточный органический материал, который устраняет необходимость временного захвата или манипулирования, и в процессе потенциально наносит вред живым организмам для приобретения генетических образцов. Кроме того, он расширяет потенциальный период, доступный для сбора образцов, за пределы традиционной фенологии или продолжительности жизни на определенном этапе жизни, повышая гибкость и общие возможности сбора, чтобы помочь максимизировать количество образцов.
В то время как основным таксоном для этого усилия была матовая эльфийская бабочка, широко распространенный, но сокращающийся специалист по среде обитания, этот протокол может быть применен более широко ко многим другим насекомым, включая тех, которые имеют проблему сохранения. Аналогичным образом, хотя протокол нацелен на сбор инкубационных яиц в качестве источника генетического материала, он может быть легко адаптирован к другим, потенциально более традиционным образцам (например, к ногам, фрагментам крыльев, антенным клипсам) или даже к целым организмам. Однако этот аспект также является потенциальным ограничением протокола. Хотя подавляющее большинство шагов предназначены для относительно простого и быстрого выполнения, всесторонний поиск участков личиночных растений-хозяев для выводящих яиц, которые по отдельности обычно <1,0 мм в диаметре, является трудоемким и трудоемким. Тем не менее, такая обширная выборочная деятельность особенно идеально подходит для более широкой сети участников, таких как общинные ученые.
Как и в случае с другими проектами на местах, необходима тщательная подготовка. Это включает в себя проведение полной инвентаризации предметов снабжения, необходимых для обеспечения отсутствия предметов снабжения, завершения любой необходимой подготовительной работы, их хорошо организованы, надежно упакованы и готовы к развертыванию на местах. Кроме того, весь персонал на местах, особенно те, кто проводит сбор тканей, должен подробно ознакомиться с протоколом сбора до любого мероприятия по сбору и адресовать любые вопросы лицам, осуществляющим надзор за проектом. Оказавшись в полевых условиях, часть протокола, посвященная сбору проб, требует тщательного внимания к деталям. Это включает в себя обнаружение и тщательный осмотр любых яйцеклеток, чтобы убедиться, что они вылуплены и, следовательно, пригодны для сбора, тщательная очистка щипцов, замена перчаток, чтобы помочь уменьшить перенос ткани между событиями отбора проб, и обеспечение того, чтобы образцы тканей были полностью погружены в буфер лизиса в каждой микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. Наконец, важное значение имеет регистрация точных и подробных данных, которые включают в себя увязку уникальной идентификационной метки, присвоенной из микроцентрифужной трубки, с конкретным взятым образцом и всей другой соответствующей информацией о сборе. Хотя этот шаг является рутинным в научных исследованиях, он часто нуждается в тщательном уточнении и усилении для научной аудитории сообщества.
Здесь мы демонстрируем потенциальное использование ученых сообщества для сбора нелетальных образцов из небольших, редких и находящихся под угрозой исчезновения видов. Тем не менее, есть некоторые потенциальные ограничения, которые следует иметь в виду при анализе любых полученных генетических данных. Например, в то время как объединение образцов из одного пластыря увеличивает шансы на восстановление достаточного количества ДНК для обнаружения, это также потенциально вводит гетерозиготность. Кроме того, поскольку протокол включает в себя сбор хориона из вылупившихся яйцеклеток, только самки бабочек, представляющие родительскую ДНК, могут быть отобраны в популяции. Тем не менее, поскольку предыдущие генетические данные на уровне популяции не были доступны для C. irus, полученные в результате идеи могут только принести пользу сохранению и управлению видами. Например, в то время как тщательный, подробный дизайн исследования и тщательный отбор маркеров потребуются для адекватной оценки структуры популяции, протокол отбора проб, изложенный здесь, и использование штрих-кодирования ДНК цитохром-соксидазы 1 (CO1) могут быть использованы для обнаружения возникновения редких или находящихся под угрозой таксонов. Дополнительное обсуждение полезности и применения секвенирования ДНК из нелетального отбора проб, описанное здесь, подробно описано Storer et. ал.14.
Помимо основной цели сбора образцов для генетического анализа, в протоколе также подчеркивается, что участники делают подробные цифровые фотографии всех полевых участков, мест сбора, присутствующих личиночных растений-хозяев и любых других элементов окружающей среды обитания, которые могут иметь отношение к делу. Такая документация помогает обеспечить общую оценку среды обитания, которая полезна для иллюстрации существующих условий участка, таких как фенология растений, плотность ресурсов хозяина и история управления (например, недавний предписанный пожар). Такая информация особенно полезна для проектов, в которых полевые пробы берутся в течение более широкого временного периода для обеспечения более подробных экологических сопоставлений.
Наконец, по мере того, как глобальное сокращение численности насекомых продолжает ускоряться, крайне необходимы расширенные усилия по оценке и мониторингу видов15,16. Использование более широкого участия со стороны общинных ученых, студентов (например, стажеров и стипендиатов Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США) и практиков в области охраны природы предлагает все более жизнеспособные варианты для обширного сбора данных многих типов, включая образцы ДНК. Соответственно, данные, генерируемые этим протоколом, имеют много возможных применений. К ним относятся помощь в информировании о природоохранных действиях (например, планирование, восстановление и управление), решения о включении в список или оценки статуса видов, а также экологические, популяционные и таксономические исследования.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Дэвида Катрелла, Аманду Диллон, Стива Фуллера, Нила Гиффорда, Хайди Холман, Дина Джу, Салли Джу, Дэниела Кеннеди, Женевьеву Козак, Ребекку Лонгенекер, Морин МакКлунг, Мэтта Морана, Робина Нивера, Бренду Смит, Хантера Троубриджа и Джессапа Вайхельта за помощь в различных аспектах проекта, включая логистику, координацию, выдачу разрешений и/или сбор проб. Это исследование финансировалось за счет гранта Службы охраны рыбных ресурсов и дикой природы США (федеральный идентификационный номер F20AC00356), администрируемого Институтом управления дикой природой (грант SA 2021-01).
Materials
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- . DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016)
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
