希少な蝶の個体群の非破壊遺伝子サンプリングを実施するためのコミュニティ科学者の派遣

1.コミュニティ科学者への物資の配布 完全な 資料表を参照して、必要なコレクション関連の備品の完全なリストを注意深く確認して収集します。 サンプル収集が複数の場所および/または複数の個人/チームによって行われる場合は、必要なすべての消耗品を収集して、個別の展開可能なユニットに整理します(図1 および 図2)。 物資(展開可能なユニット)をコミュニティの科学者またはフィールド収集を担当するその他の人員に輸送します。 担当者が現地にいない場合は、消耗品(各展開可能ユニット)を、完全な出荷ラベルと出荷が入った個別の段ボール輸送箱に慎重に梱包します。注:この段階では、迅速な発送は必要ありません。 2.コミュニティサイエンティストコレクションの準備 収集タックルボックスを含む収集用品を受け取ったら、ラミネート供給リストを注意深く確認し、完全な在庫を作成します。不足している消耗品がある場合は、プロジェクトリーダーに通知します。 1.5 mLマイクロ遠心チューブに180 μLの溶解バッファーをプレフィルし、各マイクロ遠心チューブに事前に印刷された一意のIDラベルを貼付し、すべてのチューブを64ウェルマイクロ遠心チューブ保管ボックスに入れます。装填後は蓋をしっかりと固定してください。注意: ラベルプリンターが利用できない場合は、エタノールプルーフマーカーを使用して、各バイアルの側面と蓋に一意のID番号を貼り付けます。 すべてのデジタル機器(スマートフォンやカメラなど)が完全に充電され、予備のバッテリーが梱包されていることを確認してください。 収集されたサンプルのフィールド保管とローカル輸送のために、小さなクーラーを部分的に氷で満たします。 安全な輸送と統合保管のために、すべての収集用品を収集タックルボックスまたは同様の頑丈で耐候性のある容器に詰めます。 現場に向かう前に、非破壊遺伝子サンプル収集プロトコルを詳細に確認してください。注意: 現場での追加ガイダンスについては、ラミネートおよび凝縮された図解されたプロトコルを使用してください(補足図S1および補足図S2)。 3.現場でのサンプル収集 フィールドサイトに到着したら、鉛筆または全天候型ペンを使用して、時刻、日付、全体的なプロパティ名(アパラチコーラ国有林など)、特定のフィールドサイトの場所の名前または説明、およびGPSの読み取り値(利用可能な場合)、および出席者全員のフルネームと役割を耐候性フィールドノートに記録します。 ターゲット蝶に固有の幼虫宿主植物種が存在する適切な生息地を見つけます。注意: 敏感な生息地、植物の個体数、および野生生物への影響を回避または最小限に抑えるように注意してください。さらに、サイトおよびサンプル収集イベントにアクセスする前に、すべての適切な土地所有者の許可および/または許可を確保してください。 スマートフォンまたはカメラを使用して、すべてのフィールドサイト、サンプル収集場所、ホストプラント、およびプロジェクトに関連する可能性のあるその他の情報の詳細な写真を撮ります。GPS座標を記録するスマートフォンやその他のカメラを使用してください。注:写真のジオタグは、すべてのスマートフォンで有効にする必要があります。 孵化した卵について、産卵(産卵)成体の雌蝶によって選択されることがわかっている葉、花芽、花、発育中の果実など、宿主植物の幼虫部位を網羅的に探索する。ほとんどのLycaenidaeでは、新生児の幼虫が出現したドーナツに似た中央に明確な穴がある白い孵化した卵を探します(図3)。色がやや暗く、多くの場合緑色または青みがかっており、中央に穴がなく完全に無傷の孵化していない卵を探します(図4)。ハンドレンズまたはその他の拡大装置を使用して、各卵を注意深く検査します。 孵化した卵が見つかったら、両手にニトリル手袋をはめます。 清潔で無菌の先のとがった鉗子を使用して、孵化した卵を宿主植物からつかんでそっと引き抜き、64ウェル保存ボックスから取り出した溶解バッファーを事前に充填したラベル付きマイクロ遠心チューブに直接入れます。注意: 一部のホスト植物のキャリーオーバー材料(直径15 mm未満)は許容され、収集中は正常です。 宿主植物のパッチ/サイトごとに少なくとも合計5つのサンプルを収集し(それぞれに1〜20個の孵化した卵が含まれています)、可能であればその場所で合計>50個の卵を目指します。注:これは、すべてのサンプルプラント/パッチで少なくとも一部の組織が確実に収集され、DNAを検出する可能性を高めるのに役立ちます(個人観察)。 各卵の収集後、鉗子の先端を95%エタノールのバイアルに浸すか、スクイーズボトルから95%エタノールを浸すか、アルコールワイプを使用して慎重に清掃します。注意: これは、サンプリングイベント間の組織のキャリーオーバーを最小限に抑えるのに役立ちます。 可能であれば、同じ宿主パッチ内の複数の植物からいくつかの孵化した卵(1〜20個の卵)を単一のマイクロ遠心チューブに集め、蓋をしっかりと閉じます。より大きな草本または木質の宿主種を利用する蝶種の場合、宿主パッチが限られている場合は、同じ植物の異なる場所から複数の卵を収集します。注:葉が互いに接触している場合、植物は同じ宿主パッチにあります。植物またはパッチの間に顕著な物理的分離がある場合、これは別のサンプルと見なされるべきです。幼虫の滲出液や片脚などの別の組織タイプを収集する場合は、片脚、脚の断片、または幼虫の滲出液のみを微量遠心チューブに入れます(1人あたり1サンプル)。 採取したすべての材料が、各1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の溶解バッファーに完全に沈んでいることを確認してください。問題のチューブの底を硬い表面で軽くたたいて、必要に応じてサンプルを再沈めます。 鉗子を拭いて、清潔な使い捨てラボワイプで乾かします。注意: サンプル間の相互汚染を避けるために、慎重な鉗子洗浄が不可欠です。 新しいサンプルを収集するときは、使用済みのニトリル手袋を廃棄し、きれいなペアと交換してください。 耐候性フィールドノートでは、鉛筆または全天候型ペンを使用して、マイクロ遠心チューブから割り当てられた一意のIDラベルを、サンプルの種類(卵、幼虫の滲出液、脚など)、孵化した卵のおおよその数、およびコレクター名、日付、場所、宿主植物種、および追加のメモなどのコレクション情報を記録します(図2)。 卵の破片サンプルを入れた閉じたマイクロ遠心チューブを64ウェルのマイクロ遠心機保管ボックスに戻します。 現場にいる間、64ウェルの微量遠心分離機保管ボックスを氷の入ったクーラーボックスに保管してください。 現場にいる間は、他のすべての収集用品を収集タックルボックスに維持して、サイト間の安全で統合された保管と輸送を行います。 4. フィールド収集が完了したとき サンプルを含むすべてのマイクロ遠心チューブが、輸送用の氷を備えたクーラー内の64ウェルマイクロ遠心保管ボックスに入っていることを確認します。 すべてのフィールドコレクション用品をコレクションタックルボックスに戻します。 すべてのサンプルをオフィスまたはラボに輸送し、各マイクロ遠心チューブを注意深く再確認して、すべてのサンプル材料が溶解バッファーに完全に沈んでいることを確認します。 サンプルの入った64ウェルマイクロ遠心分離機保管ボックスは、出荷または処理されるまで冷凍庫に入れます。注意: -18°Cの平均的な業務用冷凍庫は、短期保管には許容されます。 収集ツールボックス内のすべての消耗品を慎重に評価し、必要に応じて交換します。注: これは、複数のフィールド コレクション イベントがスケジュールされている場合に特に重要です。 次のフィールド収集イベントまで、収集タックルボックスを安全な場所に保管します。 すべてのデジタルイメージをダウンロードし、すべてがサーバーまたはクラウドベースのストレージシステムに安全にバックアップされていることを確認します。 すべての情報をプロジェクトのスプレッドシートまたはデータベースに入力できるようになるまで、コレクションデータを含む元の耐候性、フィールドノートブックページ、またはフィールドデータシートをスキャンするか撮影します。 5. サンプルとデータの提出 サンプルの入った64ウェル微量遠心機保管ボックスをすべて冷凍庫から取り出します。 64ウェルマイクロ遠心分離機保管ボックスをサンプルとフィールドノートブックまたはフィールドデータシートとともに標準の配送ボックスに慎重に梱包し、提供された配送ラベルを元の送信者のアカウント番号に添付し、運送業者が保証する翌日配達でプロジェクトディレクターに送付します。 パッケージ追跡番号とスキャンしたノートブックページまたはフィールドデータシートのコピーをプロジェクトディレクターに電子メールで送信します。 6.DNA抽出 64ウェルの微量遠心機保管ボックスを受け取ったら、DNA抽出の準備ができるまでサンプル中のDNAを保存するために-20°Cで保管します。 実験室では、融解後の溶解バッファーに保存された昆虫組織を-20°Cから粉砕してDNAを抽出する。 20 μLのプロテイナーゼKを加え、サンプルを56°Cの加熱インキュベーターに24時間以内一晩浸します。 特定のメーカーの推奨に従って、適切な洗浄および洗浄バッファーを追加します13。 バッファーに懸濁したサンプルを、2 mL 収集バイアルに取り付けたスピンカラムに移します。 遠心分離機を使用して6,021 × g で60秒間スピンダウンします。適切な洗浄バッファーを追加し、適切にスピンダウンします。 溶出バッファー(30 μL)を使用して結合したDNAを放出し、サンプルを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブにスピンダウンします。-20°Cで保存してください。注:DNA濃度が0.010 ng / mLを超える場合は、シーケンスに進みます。組織タイプ別のDNA濃度については 図5 を参照してください。 7. DNA配列のデータ解析 結果のシーケンスで低品質のベースコールをトリミングまたは編集します。 種の識別を確認するための公開データベースに対するクエリシーケンス。 個人間の違いを比較するために、シーケンスを互いに整列させます。