Despliegue de científicos comunitarios para realizar muestreos genéticos no destructivos de poblaciones de mariposas raras
Summary
Aquí, presentamos un protocolo sencillo para el muestreo genético no invasivo de poblaciones de mariposas basado en la recolección de residuos de huevos residuales. Se puede utilizar para confirmar la identidad de la especie y cuantificar la variación genética. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a grupos más amplios para la participación de la ciencia comunitaria.
Abstract
La disminución mundial de insectos continúa acelerándose. Se necesita críticamente un muestreo genético eficaz para avanzar en la comprensión de muchos taxones y abordar las brechas de conocimiento existentes. Este protocolo representa un método demostrado para el muestreo no destructivo de mariposas raras para la estructura genética de la población o análisis de códigos de barras de ADN. Utiliza el corion de óvulos de mariposa eclosionados para producir ADN de cantidad y calidad suficientemente altas para una secuenciación exitosa de genes para confirmar la identidad de la especie y cuantificar la variación genética. Puede ser particularmente útil cuando otras técnicas de muestreo de tejidos no son prácticas o no están disponibles. Si bien se desarrolló para un lepidóptero, podría adaptarse fácilmente para su uso con otras especies de insectos. Fue diseñado específicamente con facilidad de uso como objetivo para ayudar a maximizar la implementación amplia por parte de individuos de diferentes niveles de experiencia y habilidad, como científicos comunitarios, profesionales de la conservación y estudiantes, y para su uso en grandes áreas geográficas para facilitar un amplio muestreo de población. Los datos generados pueden ayudar a informar las decisiones taxonómicas y de listado, las acciones de conservación y gestión, y mejorar la investigación ecológica básica.
Introduction
El muestreo genético poblacional efectivo de taxones de insectos raros, en declive y/o listados a menudo es fundamental para ayudar a informar las acciones de conservación y manejo. Los métodos de muestreo de tejidos letales o perjudiciales se utilizan rutinariamente para muchos análisis genéticos. Sin embargo, estos métodos son indeseables o no están permitidos porque pueden causar daño a las poblaciones existentes vulnerables o afectar negativamente el comportamiento y la aptitud física. Varias técnicas de muestreo no letales o no invasivas que involucran tejido como patas enteras, recortes de antenas o alas, exuvias larvales o hemolinfa de secreciones defensivas y otros productos, como frass, han sido adecuadas para la investigación genética de insectos 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . La viabilidad general y la aplicabilidad de estas diversas técnicas de muestreo de tejidos varían significativamente según la biología, la ecología, el comportamiento, el tamaño y la rareza del organismo focal, la situación y los individuos que recolectan el material. Por ejemplo, las piernas enteras o los recortes de apéndices requieren la captura temporal y el manejo cuidadoso de varios individuos de una etapa de vida apropiada, generalmente por personal experimentado. Del mismo modo, es probable que las fuentes de tejidos, como las exuvias larvales o frass, solo sean prácticas si los organismos están en cautiverio o retenidos temporalmente durante un período adecuado.
Para las preguntas de investigación que se hacen a nivel de población, como las relacionadas con la posible diferenciación taxonómica o la estructura genética, a menudo se requiere un muestreo a una escala temporal o geográfica más amplia (es decir, regional o continental). Como resultado, ciertas fuentes de tejido no invasivas pueden ser completamente imprácticas o, al menos, ineficientes para recolectar en cantidad. La recolección de muestras a tales escalas también puede ser logística o financieramente poco práctica o prohibitiva para los investigadores individuales o incluso para los equipos de campo más pequeños. Si bien la participación directa de los científicos de la comunidad ha sido cada vez más adoptada por la comunidad de investigación para ayudar a abordar muchos de estos desafíos y acelerar la recopilación basada en big data, la adopción ha sido limitada para los estudios que involucran muestreo no destructivo, no invasivo o de eDNA10,11,12.
Para ayudar a superar algunas de estas limitaciones potenciales, demostramos que el corion de los óvulos de mariposa eclosionados podría producir una cantidad y calidad suficientemente altas de ADN para una secuenciación exitosa de genes para confirmar la identidad de la especie y cuantificar la variación genética. Posteriormente probamos varios protocolos de recolección utilizando esta técnica13. Este trabajo piloto sirvió de base para un mayor perfeccionamiento metodológico. Este documento describe en detalle el protocolo de recolección de campo revisado, sencillo pero completo, implementado para científicos comunitarios y otro personal no experto. Este protocolo es parte de un análisis de la estructura poblacional de la mariposa elfa helada (Callophrys irus) para ayudar a informar futuras acciones de conservación y una determinación federal de posible inclusión en la Ley de Especies en Peligro de Extinción de los Estados Unidos. Aunque potencialmente requiere más mano de obra que algunos métodos no invasivos, la falta de contacto necesario con los organismos y la facilidad de uso lo convierten en un modelo potencialmente viable que se puede aplicar a otros programas de investigación genética de poblaciones dirigidos a una selección de insectos comunes y aquellos de interés para la conservación, que dejan restos de huevos residuales de ninfas o larvas recién eclosionadas. El lenguaje de protocolo presentado aquí fue desarrollado específicamente para mariposas de la familia Lycaenidae y para uso de no expertos definidos aquí como científicos comunitarios u otros individuos (por ejemplo, biólogos de agencias, pasantes) con experiencia entomológica limitada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método de campo para muestrear de forma no destructiva mariposas raras para análisis de estructura genética de poblaciones o códigos de barras de ADN. Los beneficios generales de este protocolo están diseñados específicamente para ayudar a maximizar la implementación amplia por parte de personas de diferentes niveles de experiencia y habilidad, como científicos comunitarios, profesionales de la conservación y estudiantes. Estos incluyen un costo general relativamente bajo, suministros y equipos fáciles de adquirir, un método sencillo y accesible sin numerosos pasos demasiado complejos y fácil implementación en un área geográfica amplia. Además, se dirige al material orgánico residual que elimina la necesidad de capturar o manipular temporalmente y, en el proceso, dañar potencialmente a los organismos vivos para adquirir muestras genéticas. Además, extiende el período potencial disponible para la recolección de muestras más allá de la fenología tradicional o la vida útil de una etapa de vida particular, mejorando la flexibilidad y la oportunidad general de recolección para ayudar a maximizar el número de muestras.
Si bien el taxón focal para este esfuerzo fue la mariposa elfina helada, un especialista en hábitat generalizado pero en declive, este protocolo se puede aplicar más ampliamente a muchos otros insectos, incluidos los de interés para la conservación. Del mismo modo, si bien el protocolo se dirige a la recolección de huevos eclosionados como fuente de material genético, puede adaptarse fácilmente a otras muestras potencialmente más tradicionales (por ejemplo, patas, fragmentos de alas, clips antenales) o incluso organismos enteros. Sin embargo, este aspecto también es una limitación potencial del protocolo. Aunque la gran mayoría de los pasos están diseñados para ser relativamente simples y rápidos de lograr, la búsqueda exhaustiva de parches de plantas hospederas larvales en busca de huevos para incubar, que individualmente suelen tener < 1.0 mm de diámetro, requiere mucho tiempo y mano de obra. No obstante, una actividad de muestreo tan extensa es particularmente ideal para una red más grande de participantes, como los científicos comunitarios.
Al igual que con otros proyectos basados en el campo, la preparación cuidadosa es esencial. Esto incluye realizar un inventario completo de los suministros necesarios para garantizar que no falten artículos, que se haya completado cualquier trabajo de preparación requerido y que estén bien organizados, empaquetados de forma segura y listos para el despliegue en el campo. Además, todo el personal de campo, particularmente aquellos que realizan la recolección de tejidos, deben revisar el protocolo de recolección en detalle antes de cualquier evento de recolección y dirigir cualquier pregunta a las personas que supervisan el proyecto. Una vez en el campo, la parte de recolección de muestras del protocolo requiere una atención meticulosa a los detalles. Esto incluye localizar e inspeccionar cuidadosamente cualquier óvulo para asegurarse de que estén incubados y, por lo tanto, sean apropiados para la recolección, limpiar a fondo las pinzas, reemplazar los guantes para ayudar a reducir el arrastre de tejido entre eventos de muestreo y garantizar que las muestras de tejido estén completamente sumergidas en el tampón de lisis dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Por último, el registro de datos precisos y detallados es esencial, lo que incluye vincular la etiqueta de identificación única asignada desde el tubo de microcentrífuga junto con la muestra específica tomada y toda la demás información pertinente de la colección. Si bien este paso es rutinario en la investigación científica, a menudo necesita ser aclarado y reforzado a fondo para una audiencia científica comunitaria.
Aquí, demostramos el potencial de aprovechamiento de los científicos comunitarios para la recolección de muestras no letales de especies pequeñas, raras y amenazadas. Sin embargo, existen algunas limitaciones potenciales a tener en cuenta al analizar cualquier dato genético resultante. Por ejemplo, si bien agrupar muestras de un solo parche aumenta las posibilidades de recuperar suficiente ADN para la detección, también introduce potencialmente heterocigosidad. Además, como el protocolo implica recolectar el corion de óvulos eclosionados, solo las mariposas hembras, que representan el ADN parental, pueden ser muestreadas dentro de una población. No obstante, como no se disponía de datos genéticos previos a nivel poblacional para C. irus, los conocimientos resultantes obtenidos solo pueden beneficiar la conservación y el manejo de las especies. Por ejemplo, si bien se requeriría un diseño de estudio minucioso y detallado y una cuidadosa selección de marcadores para evaluar adecuadamente la estructura de la población, el protocolo de muestreo descrito aquí y el uso de códigos de barras de ADN de la subunidad 1 (CO1) de la subunidad 1 de la citocromo c oxidasa (CO1) podrían usarse para detectar la aparición de taxones raros o en peligro. Storer et detalla una discusión adicional sobre la utilidad y la aplicación de la secuenciación de ADN a partir de muestreos no letales descritos aquí. al.14.
Más allá del objetivo principal de recolectar muestras para análisis genético, el protocolo también enfatiza que los participantes tomen fotografías digitales detalladas de todos los sitios de campo, ubicaciones de recolección, plantas hospederas larvales presentes y cualquier otro elemento del hábitat circundante que pueda ser relevante. Dicha documentación ayuda a proporcionar una evaluación general del hábitat que es útil para ilustrar las condiciones existentes del sitio, como la fenología de las plantas, la densidad de recursos del huésped y el historial de manejo (por ejemplo, incendios prescritos recientes). Dicha información es particularmente útil para proyectos en los que se toman muestras de campo durante un período temporal más amplio para permitir comparaciones ambientales más detalladas.
Por último, a medida que la disminución mundial de insectos continúa acelerándose, se necesitan urgentemente esfuerzos ampliados de evaluación y monitoreode especies 15,16. El uso de una participación más amplia de científicos comunitarios, estudiantes (por ejemplo, pasantes y becarios del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos) y profesionales de la conservación ofrece opciones cada vez más viables para la recopilación extensa de datos de muchos tipos, incluidas muestras de ADN. En consecuencia, los datos generados a partir de este protocolo tienen muchos usos posibles. Estos incluyen ayudar a informar las acciones de conservación (por ejemplo, planificación, recuperación y manejo), decisiones de inclusión o evaluaciones del estado de las especies, e investigación ecológica, poblacional y taxonómica.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge y Jessup Weichelt por su ayuda con varios aspectos del proyecto, incluida la logística, la coordinación, los permisos y / o la recolección de muestras. Esta investigación fue financiada a través de una subvención del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos (Número de Identificación de Premio Federal F20AC00356) administrada por el Instituto de Manejo de Vida Silvestre (subvención SA 2021-01).
Materials
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton – Hot Pink – Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
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