Déployer des scientifiques communautaires pour effectuer des échantillonnages génétiques non destructifs de populations de papillons rares

1. Diffusion des fournitures aux scientifiques de la communauté Examinez attentivement et rassemblez la liste complète des fournitures liées à la collection nécessaires en consultant le tableau complet des matériaux. Si le prélèvement d’échantillons a lieu à plusieurs endroits et/ou par plusieurs personnes ou équipes, rassembler et organiser toutes les fournitures nécessaires dans des unités déployables distinctes (figure 1 et figure 2). Transporter des fournitures (unités déployables) aux scientifiques communautaires ou à d’autres membres du personnel responsables de la collecte sur le terrain. Si le personnel n’est pas local, emballez soigneusement les fournitures (chaque unité déployable) dans une boîte d’expédition en carton distincte avec une étiquette d’expédition complète et l’expédition.REMARQUE : L’expédition accélérée n’est pas requise à ce stade. 2. Préparation de la collection scientifique communautaire À la réception des fournitures de collecte, y compris la boîte à articles de collecte, examinez attentivement la liste des fournitures plastifiées et effectuez un inventaire complet. Avisez le chef de projet s’il manque des fournitures. Préremplissez les tubes de microcentrifugation de 1,5 mL avec 180 μL de tampon de lyse, apposez des étiquettes avec une étiquette d’identification unique préimprimée sur chaque tube de microcentrifugation et placez tous les tubes dans la boîte de stockage des tubes de microcentrifugeuses à 64 puits. Fixez fermement le couvercle après le chargement.REMARQUE : Si les imprimantes d’étiquettes ne sont pas disponibles, apposez des numéros d’identification uniques sur le côté et le couvercle de chaque flacon à l’aide d’un marqueur résistant à l’éthanol. Assurez-vous que tout l’équipement numérique (p. ex., téléphone intelligent ou appareil photo) est complètement chargé et que toutes les piles de rechange sont emballées. Remplissez partiellement une petite glacière avec de la glace pour l’entreposage sur le terrain et le transport local des échantillons recueillis. Emballez toutes les fournitures de collecte dans la boîte de collecte ou dans un conteneur similaire robuste et résistant aux intempéries pour un transport sûr et un stockage consolidé. Examinez en détail le protocole de prélèvement d’échantillons génétiques non destructifs avant de vous rendre sur le terrain.REMARQUE : Utilisez le protocole illustré plastifié et condensé pour obtenir des conseils supplémentaires sur le terrain (figure supplémentaire S1 et figure supplémentaire S2). 3. Prélèvement d’échantillons sur le terrain À votre arrivée sur le terrain, utilisez un crayon ou un stylo toutes saisons pour consigner dans le carnet de notes de terrain résistant aux intempéries l’heure de la journée, la date, le nom général de la propriété (p. ex., forêt nationale d’Apalachicola), le nom ou la description de l’emplacement précis du site sur le terrain, et la lecture GPS si disponible, ainsi que le nom complet et les rôles de toutes les personnes présentes. Localiser un habitat convenable avec la présence d’espèces de plantes hôtes larvaires spécifiques au papillon ciblé.REMARQUE : Soyez prudent pour éviter ou minimiser les impacts sur les habitats sensibles, les populations végétales et la faune. De plus, assurez-vous d’obtenir toutes les autorisations et/ou permis appropriés des propriétaires fonciers avant d’accéder à un site et à des événements de prélèvement d’échantillons. À l’aide d’un téléphone intelligent ou d’un appareil photo, prenez des photos détaillées de tous les sites sur le terrain, des lieux de prélèvement d’échantillons, des plantes hôtes et de toute autre information pouvant être pertinente pour le projet. Utilisez des smartphones ou d’autres appareils photo qui enregistrent les coordonnées GPS.REMARQUE: Photo Geotagging doit être activé sur tous les smartphones. Effectuez une recherche exhaustive de toutes les parties de la plante hôte larvaire, telles que les feuilles, les boutons floraux, les fleurs ou les fruits en développement, connues pour être sélectionnées par ovipositation (ponte) des papillons femelles adultes pour les œufs éclos. Pour la plupart des Lycaenidae, recherchez des œufs blancs éclos avec un trou distinct au centre ressemblant à un beignet d’où la larve nouveau-née a émergé (Figure 3). Recherchez des œufs non éclos de couleur un peu plus foncée, souvent verts ou bleuâtres, et qui seront complètement intacts sans trou au milieu (Figure 4). Utilisez une lentille à main ou un autre appareil grossissant pour inspecter chaque œuf de près. Une fois qu’un œuf éclos a été localisé, mettez des gants en nitrile sur les deux mains. À l’aide d’une pince propre, stérile et pointue, saisir et retirer doucement l’œuf éclos de la plante hôte et le placer directement dans un tube microcentrifuge étiqueté prérempli d’un tampon de lyse prélevé dans la boîte de stockage de 64 puits.REMARQUE : Certains matériaux de transfert de plantes hôtes (de moins de 15 mm de diamètre) sont acceptables et normaux pendant la collecte. Prélever au moins 5 échantillons par parcelle ou site de plantes hôtes (chacun contenant de 1 à 20 œufs éclos), en visant un total de >50 œufs à un endroit si disponible.REMARQUE : Cela permettra de s’assurer qu’au moins un peu de tissu est prélevé à chaque plante ou parcelle d’échantillon et d’augmenter les chances de détecter l’ADN (observation personnelle). Après chaque collecte d’œufs, nettoyez soigneusement les pointes des forceps en les trempant dans un flacon d’éthanol à 95% ou en les aspergeant d’éthanol à 95% dans un flacon pressé ou en utilisant des lingettes alcoolisées.REMARQUE : Cela aidera à minimiser le transfert de tissus entre les prélèvements. Si possible, recueillir plusieurs œufs éclos (1 à 20 œufs) de plusieurs plantes dans la même parcelle hôte dans un seul tube de microcentrifugeuse et fermer fermement le couvercle. Pour les espèces de papillons utilisant de plus grandes espèces hôtes herbacées ou ligneuses, prélever plusieurs œufs à différents endroits sur la même plante si les parcelles hôtes sont limitées.NOTE: Les plantes sont dans la même parcelle hôte si leurs feuilles se touchent. S’il y a une séparation physique notable entre les plantes ou les parcelles, cela devrait être considéré comme un échantillon différent. Si vous prélevez un autre type de tissu, comme des exuvies larvaires ou une seule jambe, placez une seule patte, un seul fragment de cuisse ou une seule exuvie larvaire dans un tube microcentrifuge (un échantillon par individu). Assurez-vous que tout le matériel recueilli est complètement immergé dans le tampon de lyse dans chaque tube microcentrifuge de 1,5 mL. Tapotez le fond du tube en question sur une surface dure pour réimmerger les échantillons si nécessaire. Essuyez les forceps pour sécher avec une lingette de laboratoire propre et jetable.REMARQUE: Un nettoyage soigneux des pinces est essentiel pour éviter la contamination croisée entre les échantillons. Lors du prélèvement d’un nouvel échantillon, jetez les gants en nitrile usagés et remplacez-les par une paire propre. Dans un carnet de terrain résistant aux intempéries, utilisez un crayon ou un stylo toutes saisons pour consigner l’étiquette d’identification unique attribuée au tube de microcentrifugeuse, ainsi que le type d’échantillon (p. ex. œufs, exuvies larvaires ou cuisse), le nombre approximatif d’œufs éclos et les renseignements sur la collecte tels que le(s) nom(s) du collecteur, la date, l’emplacement, l’espèce de plante hôte et toute note supplémentaire (figure 2). Replacez le tube de microcentrifugation fermé contenant l’échantillon de débris d’œufs dans la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits. Entretenez la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits dans une glacière avec de la glace sur le terrain. Conserver toutes les autres fournitures de collecte dans la boîte de collecte sur le terrain pour un entreposage et un transport sûrs et consolidés entre les sites. 4. Lorsque la collecte sur le terrain est terminée Assurez-vous que tous les tubes de microcentrifugeuses contenant des échantillons sont dans la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits dans une glacière avec de la glace pour le transport. Replacez toutes les fournitures de collecte sur le terrain dans la boîte à outils de collecte. Transportez tous les échantillons au bureau ou au laboratoire et vérifiez soigneusement chaque tube microcentrifuge pour vous assurer que tout le matériel d’échantillon est complètement immergé dans le tampon de lyse. Placez la boîte d’entreposage de microcentrifugeuses à 64 puits contenant des échantillons dans un congélateur jusqu’à l’expédition ou le traitement.REMARQUE : Un congélateur commercial moyen de -18 °C est acceptable pour l’entreposage à court terme. Évaluez soigneusement toutes les fournitures de la boîte à outils de collecte et remplacez-les au besoin.Remarque : Ceci est particulièrement important si plusieurs événements de collecte de champs sont planifiés. Rangez la boîte de collecte dans un endroit sûr jusqu’au prochain événement de collecte sur le terrain. Téléchargez toutes les images numériques et assurez-vous qu’elles sont sauvegardées en toute sécurité sur un serveur ou un système de stockage basé sur le cloud. Numérisez ou photographiez les pages originales résistantes aux intempéries, les carnets de terrain ou les feuilles de données de terrain contenant les données de collecte jusqu’à ce que toutes les informations puissent être saisies dans une feuille de calcul ou une base de données de projet. 5. Soumission d’échantillons et de données Retirez toutes les boîtes de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits avec des échantillons du congélateur. Emballez soigneusement les boîtes de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits avec des échantillons et le carnet de terrain ou les fiches techniques de terrain dans une boîte d’expédition standard, joignez l’étiquette d’expédition fournie avec le numéro de compte de l’expéditeur d’origine et envoyez par courrier express garanti, le lendemain, livraison le lendemain au directeur de projet. Envoyez par courriel le numéro de suivi du colis et une copie des pages numérisées du carnet de notes ou des fiches techniques de terrain au directeur de projet. 6. Extraction d’ADN Une fois les boîtes de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits reçues, stockez-les à -20 °C pour la préservation de l’ADN dans les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’extraction de l’ADN. En laboratoire, extraire l’ADN en broyant les tissus d’insectes stockés dans un tampon de lyse après décongélation à partir de -20 °C. Ajouter 20 μL de protéinase K et laisser l’échantillon tremper pendant une nuit à 56 °C dans un incubateur chauffé pendant au plus 24 heures. Ajouter les tampons de nettoyage et de lavage appropriés, conformément à la recommandation13 du fabricant spécifique. Transférer l’échantillon en suspension dans un tampon dans une colonne de spin fixée à un flacon de prélèvement de 2 mL. Faire tourner à 6 021 × g pendant 60 s à l’aide d’une centrifugeuse. Ajoutez les tampons de lavage appropriés et faites tourner vers le bas de manière appropriée. Libérer l’ADN lié à l’aide d’un tampon d’élusion (30 μL) et faire tourner l’échantillon dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Conserver à -20 °C.REMARQUE : Procéder au séquençage si la concentration d’ADN dépasse 0,010 ng/mL. Voir la figure 5 pour la concentration d’ADN par type de tissu. 7. Analyse des données des séquences d’ADN Rognez ou modifiez des appels de base de faible qualité dans les séquences résultantes. Interroger les séquences dans les bases de données publiques pour confirmer l’identification des espèces. Aligner les séquences les unes sur les autres pour comparer les différences entre les individus.